人类细胞质RNA提取、RT-PCR的原理、方法、琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用

2019/10/24RNA2019/10/24◆人类细胞质RNA提取◆RT-PCR的原理、方法◆琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用主要内容人类细胞质RNA提取2019/10/24电泳PCR提取总RNA合成cDNA第一链2019/10/24真核细胞RNA的种类真核细胞总RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。大多数真核细胞mRNA在其3'端均有一多聚A(PolyA)尾巴。2019/10/24实验前的准备RNA实验失败的主要原因是RNA酶的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以建立一个无RNA酶的环境对于制备RNA很重要。2019/10/24常用的RNA酶抑制剂1、焦磷酸二乙酯（DEPC）：与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合，进而使RNA酶失活，有高致癌性。（实验准备阶段使用）2、异硫氰酸胍、氯仿：提取RNA同时也使RNA酶失活。3、RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。（合成cDNA阶段使用）2019/10/24实验原理Trizol试剂盒是一种苯酚与异硫氰酸胍(GTC)的混合物，异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离。加入氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促使RNA进入水相，离心后，RNA保留在水相中，DNA和蛋白质保留在有机相中。转移水相，加入异丙醇沉淀RNA，从而得到纯化的总RNA。2019/10/24提取RNA（一）、准备试剂•氯仿•异丙醇•75℅乙醇•无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)2019/10/24提取RNA（二）、操作步骤取材:用生理盐水漱口后，含生理盐水约2~3min，用15ml离心管（4000rpm5min）收集细胞(同管多次离心)，弃上清沉淀中加入1mlTRIzol，旋涡震荡10s重悬沉淀，加样枪打匀溶液后转移至1.5mlEP管，15~30℃放置5min加入0.2ml氯仿，用手摇晃15s，15~30℃放置5min12000rpm离心15min2019/10/24提取RNA（二）、操作步骤小心吸取上清，转移至新的1.5mlEp管，加入等体积的异丙醇，15~30℃放置10min12000rpm离心15min，小心去上清，加入1ml70%乙醇，震荡数秒，8000rpm离心5min小心去上清，室温干燥5min，加入10ulDEPC水，打匀55℃水浴10分钟助溶2019/10/24提取RNA（三）、注意事项1、塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。2、有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。3、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。4、配制的溶液应尽可能用0.1%DEPC在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。5、操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。2019/10/24提取RNA（三）、注意事项6、设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。7、防止RNA酶污染（1）RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等（2）严格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污染。（3）最大限度地抑制内源性的RNA酶；而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。2019/10/24RNA保存溶解在无RNase的水或TE中，在-70℃或更低温度中保存时间在一年以内，但避免反复冻融，应分装保存。从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需溶解在去离子甲酰胺中存于-70℃，至少可以保存一年。需使用RNA时，可以加入NaAc至终浓度0.3M，12000×g离心5分钟，70%乙醇洗涤后再用无RNase的水或TE溶解。RT-PCR的原理、方法2019/10/24实验原理1、单拷贝基因表达存在逐步放大机制。2、PCR技术，即聚合酶链式反应。反应分三步：变性，退火，延伸。3、逆转录酶。可以以RNA为模板合成cDNA第一条链，或者以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA。principedoesmatter可见，RT-PCR是一种将cDNA合成与PCR技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法。RNA模板逆转录酶DNA-RNA杂化双链RNase降解RNA单链DNADNA聚合酶cDNART-PCRTaq酶2019/10/241、引物的特异性决定PCR反应特异性。2、引物设计原则的把握：（1）引物长度:一般为15～30bp（2）碱基分布（3）3‘端要求（4）引物自身二级结构（5）引物之间的二级结构（6）同源序列（7）5’端无严格限制操作步骤（一）引物设计2019/10/24操作步骤（二）RNA的提取2019/10/24操作步骤（二）RNA的提取2019/10/24（1）两步法RT-PCR操作步骤（三）cNDA合成a常用的反应体系10×RT反应缓冲液2uldNTPMixture（各10mM）2ulRNAaseinhibitor(40U/ul)0.5uloligo(dT)181ul逆转录酶1ul总RNA0.5~1ugDEPC－free水补足体系至20ul2019/10/24（1）两步法RT-PCR操作步骤（三）cNDA合成b操作在发给每人一份的已制备分装的逆转录反应管里加入8ul总RNA溶液0.2mlEp管，迷你离心机离心数秒，放置PCR仪中42℃30min（合成cDNA第一链）85℃5min（灭活逆转录酶）↓↓2019/10/24（2）一步法RT-PCR操作步骤（三）cNDA合成在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在同一管内进行。优势：在处理大量样品时易于操作；减少残余污染；可以得到更高的灵敏度。缺点：无法优化反应条件；一旦失败，必须重新提取总RNA。2019/10/24（2）一步法RT-PCR操作步骤（三）cNDA合成·0.1-1ug总RNA•200一500umol/L的dNTP(每种)•0.5umol／L基因特异引物（上下游）•200UAMV逆转录酶•1×Taq聚合酶缓冲液•0.5-15mmol／LMgCI2•1mmo1／LDTT•1.5UTaq聚台酶终体积为50ul。2019/10/24（1）50ulPCR体系的组成（即一步法）：操作步骤（四）PCR扩增2019/10/24（2）PCR反应过程：操作步骤（四）PCR扩增2019/10/24（1）引物退火温度的调节，一般在引物设计软件推荐温度的上下2℃变化寻找最佳退火温度。（2）此外Mg2＋浓度的调节也非常重要，通常最佳浓度为2mM左右。（3）引物和模板的量等。操作步骤（五）PCR条件的优化2019/10/24根据产物长度制作适宜浓度的琼脂糖凝胶（不同长度产物所需凝胶浓度）。取适量PCR产物，加上样缓冲液充分混合，点样于事先做好的琼脂糖凝胶点样孔中，10V/cm电泳45－60min。成像系统成像分析。操作步骤（六）产物的电泳和结果的测定琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用2019/10/24实验原理1、琼脂糖为链状多糖→绳状琼脂糖束→大网孔型凝胶——分离、鉴定、纯化DNA2、影响DNA迁移率的因素：DNA分子的大小、构象，凝胶浓度，电压，电泳缓冲液的组成principedoesmatter琼脂糖浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度/%线状DNA大小/kb0.50.71.01.21.52.030-112-0.810-0.57-0.43-0.22-0.052019/10/24染色和照相电泳样品的制备与加样选择电泳类型选择电泳缓冲体系琼脂糖凝胶的制备2019/10/24选择电泳类型用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型（平板型）。STEPSdoesmatter2019/10/24选择缓冲液系统常用的电泳缓冲液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TAE），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，浓度约为50mmol/L(pH7.5~7.8)。STEPSdoesmatter2019/10/24凝胶的制备以稀释的电泳缓冲液为溶剂，用微波炉配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。STEPSdoesmatter2019/10/24样品配制与加样DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油，以增加其比重，使样品集中。STEPSdoesmatter2019/10/24电泳在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。因此为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。STEPSdoesmatter2019/10/24染色与照相常用荧光染料溴乙锭（EB）染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。STEPSdoesmatter2019/10/24结果分析（一）、影响琼脂糖凝胶电泳的因素•DNA分子的大小：实验证明，DNA片段迁移距离与其分子量的对数成反比；•琼脂糖的浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂凝胶中，电泳迁移率不相同；•DNA分子的构型：不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大2019/10/24结果分析（二）、常见问题的原因和解决常见问题原因对策电泳时ladder扭曲配胶的缓冲液与电泳的缓冲液不是同时配制。同时配制，电泳缓冲液高出胶的1-2mm即可。电泳时电压过高电泳时电压不应超过20V/cm。2019/10/24结果分析（二）、常见问题的原因和解决常见问题原因对策DNA带缺尖DNA跑出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增加凝胶浓度。分子大小相近的DNA带不易分辨增加电泳时间，核准正确凝胶浓度DNA变性电泳前勿加热，用20mMNaCl缓冲液稀释DNA。DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适。在脉冲凝胶电泳上个分析。2019/10/24结果分析（二）、常见问题的原因和解决常见问题原因对策带弱或无DNA带DNA上样量不够增加DNA上样量，聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度高，上样量可适当降低。DNA降解实验过程中应避免核酸酶污染。DNA跑出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增加凝胶浓度。EB染色的DNA所用光源不合适应用短波长（254nm）的紫外光源。2019/10/24结果分析（二）、常见问题的原因和解决常见问题原因对策出现片状拖带或涂抹带酶量多或者酶的质量差，dNTP浓度高，Mg2+浓度高，退火温度过低，循环次数多。减少酶量或更换酶，减少dNTP浓度，适当降低Mg2+浓度，增加模板量，减少循环次数。不规则DNA带迁移电泳条件不合适电泳时电压不应超过20V/cm，温度30℃，巨大DNA链电泳，温度15℃，检查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换。DNA变性电泳前勿加热，用20mMNaCl缓冲液稀释DNA。常见问题原因对策DNA条带模糊DNA降解实验过程中应避免核酸酶污染。电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。TBE建议使用10就更换。所用电泳条件不合适电泳时电压不应超过20V/cm，温度30℃，巨大DNA链电泳，温度15℃，检查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换。DNA上样量过多减少凝胶中DNA上样量DNA含盐过高电泳前通过乙醇沉淀去除多余盐分。有蛋白污染电泳前酚抽提去除蛋白。DNA变性电泳前勿加热，用20mMNaCl缓冲液稀释DNA。2019/10