人类RNA的提取、RT-PCR技术以及琼脂糖凝胶电泳

RNA与琼脂糖凝胶电泳的那些事儿作者：临床医学1303班5组第2小组cataloguepart1：人类细胞质RNA的提取part2：RT-PCR的原理和方法part3：琼脂糖凝胶电泳结果的分析及其应用part1人类细胞质RNA的提取原理步骤（以Trizol试剂为例）一、原理RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。二、步骤（以Trizol试剂为例）Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。Trizol在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化RNA及标准化RNA的生产十分有用。准备工作取材组织样品的处理氯仿抽提异丙醇沉淀RNA酒精洗涤RNARNA溶解NAME1．准备工作提取RNA前先打开冷冻离心机预冷，制好冰，用70%的酒精擦拭加样枪、离心管架和桌面，一次性手套，研钵，DEPC处理的tip、EP管等。2．取材取新鲜动物组织，立即置于冻存管投入液氮中速冻，在液氮中可保存一年左右，-80℃可保存三个月。3．组织样品的处理研磨法：戴好厚手套和口罩，取约0.1~0.2g冻存组织，于液氮充分预冷的研钵中用力研磨，期间不断加入液氮，充分研碎组织，小心别把组织洒到外面。将组织粉末用小勺移入1.5mL的EP管中，立即加入1mLTrizol（或预先加入），剧烈摇匀15s，室温静置5min。组织或细胞可适当延长在Trizol中裂解的时间，能获得较多的RNA。匀浆法：取新鲜动物组织（或冷冻组织）0.1～0.2g迅速倒入匀浆器中，加入1mL预冷的Trizol，在冰浴中迅速匀浆20~30s然后将细胞悬液吸入另一EP管，室温静置5min。细胞样品处理：贴壁细胞，完全除去培养液后直接向培养皿中加入1mLTrizol反复吹打几次，转入EP管，静置5min。样本在Trizol中，-20℃至少可保存3天，-80℃可长久保存。NAME4．氯仿抽提加入400μL氯仿，剧烈振摇15s混匀后，室温静置3min，4℃，12000r/min离心15min，RNA分布于水相中。将上层无色水相转移到另一Ep管中，防止吸到中间层蛋白。若抽提不彻底，可加200μL氯仿重复抽提一次。5．异丙醇沉淀RNA加入800μL异丙醇，充分混匀，室温静置10min（细胞RNA-20℃静置20min），4℃，12000r/min离心10min，即可观察到管底的RNA沉淀，小心倾去上清液，将EP管倒扣在RNaseFree的吸水纸上2~3min除去残留的异丙醇。6．酒精洗涤RNA加入0.7mL无水乙醇+200µLDEPC水洗涤RNA沉淀物，4℃，8000r/min离心5min，弃上清液，将EP管倒扣在RNaseFree的吸水纸上室温干燥3~5min。7．RNA溶解向干燥过的沉淀物中加入20μLDEPC处理水（RNaseFree水）50℃溶解10min，于-80℃保存备用。溶解后的RNA容易被RNase降解，应尽量低温保存。为了防止痕量的RNase污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏等）中分离得到的RNA应贮存在甲醛中，以保存高质量的RNA。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中保存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA在水中保存三年仍保持稳定。part2RT-PCR原理方法PCR定义：PCR即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶的催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。反应分三步：A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNAB、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5'3'方向延伸。以上三步为一个循环，如此反复。简介RT-PCR为反转录PCR(reversetranscriptionPCR)的缩写。它是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。一、原理提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。二、方法方法一：反转录-第一链cDNA合成、PCR合成第二链方法二：反转录-聚合酶链反应（RT-PCR扩cDNA）part3琼脂糖凝胶电泳结果分析应用一、结果分析琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳技术”的双重作用。所谓分子筛，就是它只允许直径比孔径小的分子进入，因此能将混合物中的分子按大小加以筛分。电泳，就是溶液中的带电颗粒在电场中朝着与其自身所带电荷相反的方向移动的现象，利用这种现象将电场中不同带电颗粒区分的方法就是电泳技术。以下为结果分析中常见的问题。凝胶电泳结果分析常见问题原因对策DNA条带模糊DNA降解实验过程中应避免核酸酶污染。电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。TBE建议使用10就更换。所用电泳条件不合适电泳时电压不应超过温度DNA上样量过多减少凝胶中DNA含盐过高电泳前通过乙醇沉淀去除多余盐分。有蛋白污染电泳前酚抽提去除蛋白。DNA变性电泳前勿加热，用用20mMNaCl缓冲液稀释DNA。出现片状拖带或涂抹带PCR扩增时出现涂抹带、片状带或地毯样带，往往由于酶量多或者酶的质量差，dNTP浓度高，Mg2+浓度高，退火温度过低，循环次数多。减少酶量或更换酶，减少dNTP浓度，适当降低Mg2+浓度，增加模板量，减少循环次数。不规则DNA带迁移电泳条件不合适电泳时电压不应超过20V/cm，温度30℃，巨大DNA链电泳，温度15℃，检查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换。带弱或无DNA带DNA上样量不够增加DNA上样量，聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度高，上样量可适当降低。DNA降解实验过程中应避免核酸酶污染。DNA跑出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增加凝胶浓度。EB染色的DNA所用光源不合适应用短波长（254nm）的紫外光源。DNADNA跑出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增加凝胶浓度。分子大小相近的DNA带不易分辨增加电泳时间，核准正确凝胶浓度DNA变性电泳前勿加热，用20mMNaCl缓冲液稀释DNA。DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适。在脉冲凝胶电泳上个分析。电泳时配胶的缓冲液与电泳的缓冲液不是同时配制。同时配制，电泳缓冲液高出胶的1-2mm即可。电泳时电压过高电泳时电压不应超过20V/cm。二、应用1、DNA的制备•分离大片段DNA•提取大分子DNA•PCR产物在琼脂糖凝胶上进行的电泳检测2、免疫扩散法免疫扩散法就是利用琼脂糖凝胶作为扩散介质，使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可见的带状或线状沉淀带。抗原抗体复合物的沉淀带是一种特异性的半渗透性屏障，它可以阻止免疫学性质与其相似的抗原抗体分子通过，而允许那些性质不相似的分子继续扩散，这样由不同抗原或不同抗体所形成的沉淀带各有各的位置，从而可以分离和鉴定混合系统。TheEndThankyouforlistening