RT-PCR

逆转录聚合酶链式反应RT-PCR报告人：王瑶、刘荣荣、张勇欢、姜雷一、定义二、原理逆转录(reversetranscription，RT)以RNA为模板，合成与其互补的DNA（cDNA）的过程。逆转录酶(依赖RNA的DNA聚合酶)1.RNA指导的DNA聚合酶活性2.RNA水解酶活性3.DNA指导的DNA聚合酶活性过程RNA模板单链DNA双链DNADNA-RNA杂化双链聚合酶链式反应--PCR一种将微量的目的DNA片段在体外快速、大量扩增的技术。以目的DNA（待扩增DNA）分子为模板，一对分别与模板3’末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成2条新DNA链的合成。不断重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。PCR试管内模拟细胞内DNA半保留复制三、方法两步法RT与PCR分开进行各自在最优化的条件下进行两步法通常是取第一步反应产物的1/10进行第二步反应，使得其灵敏度不如一步法高。多个基因的RT-PCR一步法RT与PCR同时进行RT和PCR都不能在最佳条件下进行并且容易相互干扰简便操作、减少污染的可能性由于得到的全部cDNA产物都一起经PCR扩增，使得一步法的灵敏度更高（一）两步法RNA的提取反转录（RT）PCR一、实验前准备需准备好实验所用的试剂：如0.1%DEPC溶液，Trizol，氯仿，异丙醇，DEPC水配制的75%乙醇，RNase-free的纯水，反转录试剂盒、dNTPmix,Taq酶,buffer、凝胶电泳缓冲液等。所涉及到的仪器、耗材：离心管，PCR管，PCR仪，冷冻离心机，水平电泳槽，电泳仪等。二、引物设计本实验使用Primer6软件设计引物。根据GC含量和Tm值，确定比较适合的引物，并保存序列。三、总RNA的提取：TRIzol试剂提取RNA1.取新鲜动物组织0.1～0.2g置于组织匀浆器中，加入预冷的Trizol液1ml，在冰浴中迅速匀浆15～30s，以充分研碎组织。然后将组织悬浮液吸入另一1.5mlEp管中，于室温下静置5min。2.加入200μl氯仿，剧烈振摇15s混匀后，室温静置2~3min。3.4℃，10000r/min离心15min，RNA分布于水相中。4.将上层无色水相转移到另一Ep管中，加入500μl异丙醇，室温静置10min。5.4℃，10000r/min离心10min。6.弃上清液，用1ml75%乙醇洗涤RNA沉淀物，4℃，7500r/min离心5min。7.弃上清液，室温干燥15min.8.向干燥过的沉淀物中加入200μlDEPC处理水溶解沉淀物，于-20℃保存备用。四、反转录反应（以TianGen试剂盒为例）1.配制gDNA去除反应体系混合液：5×gDNABuffer2μl；TotalRNA；RNase-FreeddH2O补足到10μl。彻底混匀，简短离心，并置于42℃孵育3min，然后放置于冰上。2.配制反转录反应体系混合液，10×FastRTbuffer2μl；RTEnzymeMix1μl；FQ-RTPrimerMix2μl；RNase-FreeddH2O补足到10μl。3.将反转录反应中的Mix加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。4.于42℃孵育15min。5.95℃孵育3min后，将管插入冰中，-20℃保存备用。模板DNA:基因组DNA、cDNA等特异引物:与模板DNA特异互补的单链寡聚dNTP片段，一般18-30bp,上下游引物0.2-0.5μmol/L。DNA聚合酶:具耐热性、如Taq酶0.5-5U/100μl底物:等浓度的四种核苷酸（dNTP）20-200μmol/L反应环境:含有Mg2＋的Tris-Cl缓冲液。五、PCRPCR反应的条件•预变性：94℃，2-10min•变性：94℃,30s,模板DNA变性成为单链•退火：Tm-5℃,30s，引物与模板DNA结合•延伸：72℃，DNA聚合酶催化DNA合成时间与待扩增片段长度有关，1Kb,1min；1Kb,延长时间重复25-30cycle.•最终延伸：72℃，10min。六、凝胶电泳检测1.制备1%的琼脂糖凝胶，在锥形瓶中加入0.3g琼脂糖和30mlTAE缓冲液，盖上保鲜膜，微波炉加热至琼脂糖全部融化。2.待混合物冷却至50-60℃时，将其倒入胶槽中。凝胶凝固后，轻轻拔去梳子，将胶放入电泳槽中，并倒入适量的TAE缓冲液。3.将样品和LoadingBuffer混匀后，加到上样孔中，并点上2μl的Marker。90V恒压电泳，指示剂迁移至凝胶的2/3处，即可停止电泳。4.取出凝胶，置于EB中浸泡20min后凝胶扫描仪下查看电泳结果。（二）一步法反应体系（TiangenKR113Kit）一步法反应条件四、RT-PCR应用1.检测细胞中基因表达水平。2.检测细胞中RNA病毒的含量。3.直接克隆特定基因的cDNA序列。THANKS