蛋白质一级结构测定

第三章蛋白质的一级结构的测定蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。蛋白质的一级结构的测定是一项非常复杂的工作A.样品必需纯（97%以上）；B.知道蛋白质的分子量；C.知道蛋白质由几个亚基组成；D.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。E.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。（1）测定蛋白质的一级结构的要求（2）蛋白质分子的一级结构测定方法氨基酸组成分析氨基酸末端分析蛋白质中肽链的拆离肽链的部分降解及肽片断的分离肽段氨基酸顺序测定及肽段重叠二硫键与酰胺基的定位①测定蛋白质氨基酸残基组成根据蛋白质分子量，计算出构成蛋白质的各种氨基酸的数量；采用经典的阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后衍生法，对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行分析。②测定蛋白质分子中多肽链的数目通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分单独分离出来；几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基；用过氧酸氧化或巯基化合物还原二硫键断裂，用烷基化试剂保护生成的巯基，防止其重新被氧化；如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。③二硫健的断裂及多肽链的拆分★巯基的保护-OOCCHCH2SHNH3+ICH2CNH2OCH2OCClOCH2Cl-OOCCHCH2SNH3+OCCH2OCH2-OOCCHCH2SNH3+CH2CNH2O-OOCCHCH2SNH3+用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化用酶溴化氢选择性降解多肽链产生的肽段用酸水解、碱水解（针对色氨酸分析）或酶水解后，用氨基酸自动分析仪测定；测定并计算出蛋白质的氨基酸种类和数量；用Edman反应分析各肽段氨基酸顺序；④多肽链的选择性降解及肽段的氨基酸组成和顺序的测定获得的各肽段的氨基酸顺序彼此间的交替重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序；确定多肽链中二硫键的位置。⑤利用酶选择性降解和溴化氰选择性降解2、多肽链氨基酸顺序分析•多肽链降解必须满足两个条件：选择性强、反应产率高主要方法包括酶解法和化学法某些蛋白水解酶能够选择性的水解多肽链中的某一类肽键；主要有胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶；糜蛋白酶（chymotrypsin):苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、组氨酸；胃蛋白酶（pepsin)：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、以及其他疏水性强酶解法•特点：专一性较强，水解速度快•断裂位点：赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键•R1=Lys（赖、K）和Arg（精、R）•R2=Pro（抑制）NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链水解位点胰蛋白酶（trypsin）•特点：专一性稍弱，Leu、Met和His稍慢•断裂位点：Phe（苯丙）、Trp（色）、Tyr（酪）等疏水氨基酸残基的羧基端肽键•R1=Phe（F）、Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AA•R2=Pro（抑制）NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链水解位点糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）水解速度与相邻AA性质有关:酸性：-/碱性：+•特点专一性与糜蛋白酶相似，较弱；•断裂位点：两侧的残基都是疏水性氨基酸•R1和/或R2＝Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）及其它疏水性AA水解速度较快•R1=Pro（抑制）•pH2.0NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链水解位点胃蛋白酶Pepsin特点：专一性较差断裂位点：Leu、Ile、Phe、Trp、Val、Tyr、Met等疏水性强氨基酸残基的羧基端肽键•R2=Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性强的AA水解速度较快嗜热菌蛋白酶（thermolysin)木瓜蛋白酶：专一性差断裂位点：对Arg和Lys残基的羧基端肽键敏感葡萄球菌蛋白酶：高专一性断裂位点：Glu和Asp残基的羧基端肽键——磷酸缓冲液Glu残基的羧基端肽键——碳酸氢铵、醋酸铵缓冲液）梭菌蛋白酶：高专一性断裂位点：Arg残基的羧基端肽键溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。化学法---选择性地切割由Met羧基形成的肽键CH3S：CH2CH2CHNHCNHCHCOOR+BrC+NBr-CH3S+CH2CH2CHNHCNHCHCOORCNCH3SCNCH2CHNHCNHCHCOORCH2+H2O+CH2CHNHCOCH2OH3N+CHCOR高丝氨酸内酯溴化氰水解法(Cyanogenbromide)N末端的测定二硝基氟苯法（DNFB法）；二甲氨基萘磺酰氯法(DNS-CL法）；异硫氰酸苯脂法（PITC法）；C末端的测定羧肽酶法；硼氢化锂法；肼解法（2）多肽链的末端氨基酸测定N末端测定方法比较C末端更加成熟、可靠和准确，主要的方法有：二硝基氟苯法（DNFB法）肽链N末端氨基与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应，生成二硝基苯的衍生物（DNP-肽），其经酸水解后生成的DNP-氨基酸可用有机溶剂（如乙酸乙酯）抽提，再与其他氨基酸分开，鉴定得知N末端的氨基酸。N末端的测定二硝基氟苯法(FDNB,DNFB):1945年Sanger提出此方法。荧光剂二甲氨基萘磺酰氯（dansyl-chloride,DNS-Cl）可以作为标记试剂专一地与肽链N末端氨基反应生成DNS-肽；同样，酸水解后可得DNS-氨基酸，用乙酸乙酯抽提，然后用层析法鉴定；DNS-氨基酸于360nm或280nm处产生强烈的荧光，根据荧光点的位置，确定N末端的氨基酸。此方法反应原理同DNFB法，但其灵敏度比DNFB法高约100倍，用于层析分析的样品只需1nmol。二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）二甲基氨基萘磺酰氯法,丹磺酰氨基酸具有强烈的黄色荧光,灵敏性是DNFB法的100倍.•基本原理：偶联--环化--转化异硫氰酸苯酯能与N末端氨基偶联生成苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-肽）异硫氰酸苯酯法（PITC法）在酸性溶液中，PTC-肽经环化裂解生成PTC-氨基酸和N末端少一个氨基酸的剩余多肽，前者可用于N末端氨基酸鉴定，但是该产物不稳定，很快进一步转化成3-苯基-2-乙内酰硫脲-氨基酸（PTH-氨基酸）。生成的PTH-氨基酸非常稳定，它在268nm处有强吸收峰。剩余多肽链的N末端仍是自由的，可以进一步与异硫氰酸苯酯反应进行第二步降解。这样就可以从N末端开始逐次降解下去，进行顺序测定。该方法也称Edman顺序降解，它是制造氨基酸顺序分析仪的理论基础。一般说来，C末端测定较N末端分析的误差大。可采用的方法有：1．羧肽酶法：羧肽酶能特异地水解C末端氨基酸形成的肽链，而用于测定C末端氨基酸。羧肽酶分A、B、C、Y4种，羧肽酶A使用最多，但对C末端的Pro、Arg、Lys及Hyp不起作用。羧肽酶B，只释放C末端的Lys和Arg，可以和羧肽酶A互补使用。羧肽酶C的作用范围宽。但对C末端的Hyp或连续几个甘氨酸（-Gly-Gly-Gly）无作用。羧肽酶Y也具很宽的作用范围。2．硼氢化锂法（LiBH4法，也称“还原法”）：硼氢化锂可以与C末端氨基反应生成相应的α-氨基醇，水解后抽提氨基醇，可用层析法分离、鉴定。3．肼解法（hydrazinolysis）：测定C末端氨基酸一种较为重要的方法。多肽与无水肼发生反应时，肼可断裂所有的肽键形成肼的衍生物，唯有C末端氨基酸以游离形式存在，故可通过层析鉴定。C末端的测定亚基拆离、肽链降解和肽段的分离亚基切成小段蛋白分子