发酵工程技术概论

第七章发酵工程技术概述本章重点：优良菌种的选育发酵工艺的控制内容第一节概述第二节优良菌种的选育第三节发酵的基本过程第四节发酵方式第五节发酵工艺控制第六节发酵产物的提取第七节发酵设备第八节发酵工程产品的制造实例第九节基因工程在发酵中的应用第十节发酵工程的发展展望第一章概述发酵工程发酵已经从过去简单的生产酒精类饮料、生产醋酸和发酵面包发展到今天成为生物工程的一个极其重要的分支，成为一个包括了微生物学、化学工程、基因工程、细胞工程、机械工程和计算机软硬件工程的一个多学科工程。现代发酵工程不但生产酒精类饮料、醋酸和面包，而且生产胰岛素、干扰素、生长激素、抗生素和疫苗等多种医疗保健药物，生产天然杀虫剂、细菌肥料和微生物除草剂等农用生产资料，在化学工业上生产氨基酸、香料、生物高分子、酶以及维生素和单细胞蛋白等。FERMENTATIONProcessControlFermentationengineering上游工程UPSTREAMPROCESSES下游工程DOWNSTREAMPROCESSES发酵工程组成从广义上讲，由三部分组成：上游工程、发酵工程、下游工程UPSTREAMPROCESSES-genetics,cell…-inoculumdevelopment-mediaformulation-sterilization-inoculationFERMENTATIONProcessControl上游工程FermentationengineeringDOWNSTREAMPROCESSES-productextraction,purification&assay-wastetreatment-byproductrecoveryFERMENTATIONProcessControl下游工程TheratioofrecoverytofermentationcostsforL-asparaginase:3.0ethanol:0.16Fermentationengineering发酵工程主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术(1)有严格的无菌生长环境：包括发酵开始前采用高温高压对发酵原料和发酵罐以及各种连接管道进行灭菌的技术；在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术；(2)在发酵过程中根据细胞生长要求控制加料速度的计算机控制技术；(3)种子培养和生产培养的不同的工艺技术。(4)在进行任何大规模工业发酵前，必须在实验室规模的小发酵罐进行大量的实验，得到产物形成的动力学模型，并根据这个模型设计中试的发酵要求，最后从中试数据再设计更大规模生产的动力学模型。(5)由于生物反应的复杂性，在从实验室到中试，从中试到大规模生产过程中会出现许多问题，这就是发酵工程工艺放大问题。微生物发酵技术1857年法国化学家、微生物家巴斯德提出了著名的发酵理论：“一切发酵过程都是微生物作用的结果。”巴斯德认为，酿酒是发酵，是微生物在起作用；酒变质也是发酵，是另一类微生物在作祟；随着科学技术的发展，可以用加热处理等方法来杀死有害的微生物，防止酒发生质变。同时，也可以把发酵的微生物分离出来，通过人工培养，根据不同的要求去诱发各种类型的发酵，获得所需的发酵产品。利用微生物的特点发酵工程所利用的微生物主要是细菌、放线菌，酵母菌和霉菌利用微生物的特点：(1)对周围环境的温度、压强、渗透压、酸碱度等条件有极大的适应能力(2)有极强的消化能力(3)有极强的繁殖能力UseofMicroorganismsPositive（益处）BiomassProductionConversionNegative（危害）PathogensSpoilage一、发酵的定义1、传统发酵2、生化和生理学意义的发酵3、工业上的发酵1、传统发酵最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。2、生化和生理学意义的发酵指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。3、工业上的发酵泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程包括：1.厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。2.通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等。产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。二、发酵工业1.定义：是指利用生物的生命活动产生的酶，无机或有机原料进行酶加工，获得产品的工业。适宜的微生物保证或控制微生物进行代谢的各种条件进行微生物发酵的设备精制成产品的方法的设备2.获得发酵产品的条件三、发酵工业的发展历史发酵工程发展的4个阶段（了解）人类利用微生物发酵制造所需产物有几千年的历史，但对其过程的原理、反应步骤、物质变化、调控机制等的认识主要在20世纪完成的。其发展大体可分为以下4个阶段：1.第一阶段：传统微生物阶段20世纪以前时期主要生产葡萄酒、酒、醋、酱、奶酪等。1675年荷兰人列文虎克发明显微镜，首次观察到微生物1857-1876年，巴斯德提出“一切发酵过程都是微生物作用的结果，发酵是没有空气的生命过程，微生物是引起化学变化的作用者。”——生物工程之父像牛顿开辟出经典力学一样，巴斯德开辟了微生物领域，他也是一位科学巨人巴斯德·路易斯（LouisPasteur），法国微生物学家、化学家，近代微生物学的奠基人巴斯德·路易斯曲颈瓶实验巴氏消毒法酒精发酵,醋酸发酵的机理减毒疫苗在食品工业上的应用主要包括以下三方面。第一，生产传统的发酵产品，如啤酒、果酒、食醋等，使产品的产量和质量得到明显的提高。第二，生产各种食品的添加剂。第三，帮助解决粮食问题。2.第二阶段：1900-1940——有机酸工业新的发酵产品不断问世，主要有酵母、甘油、乳酸、柠檬酸、丁醇和丙酮等。是第一个进行大规模工业生产的发酵过程，也是工业生产中首次采用大量纯培养技术的工艺。河南省郸城金丹乳酸实业有限公司3.第三阶段：1942-1952——抗生素工业世界上第一个抗生素产品是青霉素，第二个抗生素是链霉素。青霉素工业化成功推动了发酵工业的发展，主要标志有：深层发酵、生产大规模化、多种抗生素、氨基酸、核酸发酵成功，甾体的微生物转化。谷氨酸发酵的生产实例谷氨酸钠是味精的主要成分谷氨酸棒状杆菌合成谷氨酸的途径在工厂里是怎样应用谷氨酸棒状杆菌来生产谷氨酸的？4.第四阶段从DNA双螺旋结构模型的提出到质粒的不断发现，生物工程的新飞跃已具备了一切条件。分子生物学和基因工程、细胞工程的发展为微生物工程的发展创造了条件。重组DNA和细胞融合技术能打破物种之间的屏障，获得“杂交”分子的新产物，而且通过活化微生物的某些沉默基因，也可获得一些新结构的活性物质。三、发酵工程的研究内容主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术(1)有严格的无菌生长环境：包括发酵开始前采用高温高压对发酵原料和发酵罐以及各种连接管道进行灭菌的技术；在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术；(2)在发酵过程中根据细胞生长要求控制加料速度的计算机控制技术；(3)种子培养和生产培养的不同的工艺技术。(4)在进行任何大规模工业发酵前，必须在实验室规模的小发酵罐进行大量的实验，得到产物形成的动力学模型，并根据这个模型设计中试的发酵要求，最后从中试数据再设计更大规模生产的动力学模型。(5)由于生物反应的复杂性，在从实验室到中试，从中试到大规模生产过程中会出现许多问题，这就是发酵工程工艺放大问题。发酵工业的生产水平取决于三个要素：生产菌种、发酵工艺和发酵设备。思考题填空1.在发酵工程发展过程中，——发明了显微镜，——被称为“生物工程之父”。2.世界上第二个抗生素是——。3.发酵工业的生产水平取决于三个要素：——、——、——。第二节优良菌种的选育发酵工业的生产水平的决定因素之一是生产菌种，故发酵工程产品开发的关键之一是筛选新的有用的物质的生产菌种。菌种的来源：根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。从自然界筛选目的提高生产能力提高产品质量开发新产品解决生产实际问题防止菌种退化菌株选育、分子改造菌种选育方法有：自然选育、诱变选育、杂交育种等，还包括控制杂交育种、原生质体融合、基因工程育种等。一、菌种选育的物质基础DNA是微生物遗传的物质基础，基因是遗传物质的基本功能单位，每个基因包含几百对以上的核苷酸，只要其中一对发生交换或突变就会导致遗传性状的改变。决定遗传性状的DNA主要集中在染色体上，只有少许游离在外DNA分子结构的改变是诱变育种的工作根据，染色体搭配的变化交换是杂交育种的根据。对DNA子结构和它复制过程的了解将更有利于充实诱变育种的理论根据二、自然育种※定义：不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程。自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9，一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。问题：高产菌株是正突变还是负突变？自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变自然选育操作步骤：一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。单细胞(孢子)悬液的制备平板分离挑选单菌落(注意形态的观察)发酵试验三、诱变育种※定义：用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变筛选高产菌种的过程。1.诱变机制：由诱变而导致微生物DNA的微细结构发生的变化，主要分为微小损伤突变:碱基的置换、码组移动突变染色体畸变:易位、倒位、缺失、重复染色体组突变:细胞内染色体组的改变△2.诱变剂及其作用方式诱变剂：能诱发基因突变并使突变率提高到超过自发突变水平的物理化学因子。可分为三大类：物理诱变剂：UV、X射线、γ射线等化学诱变剂：亚硝酸胍、氮芥等生物诱变剂：噬菌体3.诱变和筛选首先要制定明确的筛选目标，其次是制定合理的步骤，再次是建立正确快速的测定方法和摸索培养最适条件。诱变剂处理过程中几个有关的问题化学诱变剂使用过程的安全性；诱变剂量的选择；诱变剂的选择；出发菌株的选择。筛选的方法：随机筛选：形态：理性化筛选：从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛选而产生的这些特性，称为遗传标记。四、原始质体融合用脱壁酶除去细胞壁，制成原生质体，再用聚乙二醇（PEG）促进原生质体发生融合，从而获得异核体活重组子的技术。原生质体融合于1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出，是基因重组的一种重要方法原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化技术，原生质体诱变育种等。1.步骤（1）标记菌株的筛选和稳定性验证。（2）原生质体制备。（3）等量原生质体加聚乙二醇促进融合。（4）涂布于再生培养基，再生出菌落。（5）选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。（6）生产性能筛选。2.影响因素（1）菌龄：一般采用对数前期的菌体进行酶解。（2）培养基组分：限制性培养基上比在完全培养基上原生质体形成效果好。（3）PEG：必须物质，其分子量和浓度影响融合效果。（4）外界因素：思考题一、名词解释自然育种诱变育种诱变剂原生质体融合二、填空1.有诱变而导致微生物DNA的微细结构发生变化，主要分为——、——和——。2.诱变剂有很多中，可分为——、——和——三大类。3.原生质体融合育种一般选用——作为助融剂。三、选择原生质体融合时，菌龄对原生质体的形成影响很大，一般采用——的菌体进行酶解，原生质体形成率较高。A.延迟期B.对数前期C.对数后期D.稳定期第三节发酵的基本过程发酵的基本过程为：菌种种