发酵工程综述

发酵工程综述发酵工程的内容是随着科学技术的发展而不断扩大和充实的。现代的发酵工程不仅包括菌体生产和代谢产物的发酵生产，还包括微生物机能的利用。其主要内容包括生产菌种的选育，发酵条件的优化与控制，反应器的设计及产物的分离、提取与精制等。1发酵类型目前已知具有生产价值的发酵类型有以下五种：1.1微生物菌体发酵这是以获得具有某种用途的菌体为目的的发酵。比较传统的菌体发酵工业，有用于面包制作的酵母发酵及用于人类食品或动物饲料的微生物菌体蛋白发酵两种类型。新的菌体发酵可用来生产一些药用真菌，如香菇类、依赖虫蛹而生存的冬虫夏草菌、与天麻共生的密环菌、以及从多孔菌科的茯苓菌获得的名贵中药茯苓和担子菌的灵芝等。这些药用真菌可以通过发酵培养的手段来产生与天然产品具有同等疗效的产物。有的微生物菌体还可用作生物防治剂，可制成新型的微生物杀虫剂，并用于农业生产中。因此菌体发酵工业还包括微生物杀虫剂的发酵。1.2微生物酶发酵酶普遍存在于动物、植物和微生物中。最初，人们都是从动、植物组织中提取酶，但目前工业应用的酶大多来自微生物发酵，因为微生物具有种类多、产酶品种多、生产容易和成本低等特点。微生物酶制剂有广泛的用途，多用于食品工业和轻工业中，如微生物生产的淀粉酶和糖化酶用于生产葡萄糖，氨基酰化酶用于拆分D、L-氨基酸等。1.3微生物代谢产物发酵微生物代谢产物的种类很多，已知的有37个大类。在菌体对数生长期所产生的产物，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、糖类等，是菌体生长繁殖所必需的，这些产物叫做初级代谢产物。许多初级代谢产物在经济上具有相当的重要性，分别形成了各种不同的发酵工业。在菌体生长静止期，某些菌体能合成一些具有特定功能的产物，如抗生素、生物碱、细菌毒素、植物生长因子等。这些产物与菌体生长繁殖无明显关系，叫做次级代谢产物。次级代谢产物多为低分子量化合物，但其化学结构类型多种多样，据不完全统计多达47类。其中抗生素按其结构类型相似性，可分为14类。由于抗生素不仅具有广泛的抗菌作用，而且还有抗病毒、抗癌和其他生理活性，因而得到了大力发展，已成为发酵工业的重要支柱。1.4微生物的转化发酵微生物转化是利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物转变成结构相关的更有经济价值的产物。可进行的转化反应包括：脱氢反应、氧化反应、脱水反应、缩合反应、脱羧反应、氨化反应、脱氨反应和异构化反应等。最古老的生物转化，就是利用菌体将乙醇转化成乙酸的醋酸发酵。生物转化还可用于把异丙醇转化成丙醇；甘油转化成二羟基丙酮；葡萄糖转化成葡萄糖酸，进而转化成2—酮基葡萄糖酸或5—酮基葡萄糖酸；以及将山梨醇转变成L—山梨糖等。此外，微生物转化发酵还包括甾类转化。1.5生物工程细胞的发酵这是指利用生物工程技术所获得的细胞，如DNA重组的“工程菌”以及细胞融合所得的“杂交”细胞等进行培养的新型发酵，其产物多种多样。用基因工程菌生产的有胰岛素、干扰素、青霉素酰化酶等，用杂交瘤细胞生产的用于治疗和诊断的各种单克隆抗体等。2发酵技术的特点微生物种类繁多、繁殖速度快、代谢能力强，容易通过人工诱变获得有益的突变株；微生物酶的种类很多，能催化各种生物化学反应；微生物能够利用有机物、无机物等各种营养源；可以用简易的设备来生产多种多样的产品；不受气候、季节等自然条件的限制等优点。所以源于酒、酱、醋等酿造技术的发酵技术发展非常迅速，并具有以下特点：①发酵过程以生命体的自动调节方式进行，数十个反应过程能够在发酵设备中一次完成；②反应通常在常温常压下进行，条件温和，能耗少，设备较简单；③原料通常以糖蜜、淀粉等碳水化合物为主，可以是农副产品、工业废水或可再生资源(如植物秸秆、木屑等)，微生物本身能有选择地摄取所需物质；④容易生产复杂的高分子化合物，能高度选择地在复杂化合物的特定部位进行氧化、还原、官能团引入或去除等反应；⑤发酵过程中需要防止杂菌污染，大多情况下设备需要进行严格的冲洗、灭菌，空气需要过滤等。3发酵技术的应用发酵过程的上述特点体现了发酵工程的种种优点。在目前能源、资源紧张，人口、粮食及污染问题日益严重的情况下，发酵工程作为现代生物技术的重要组成部分之一，得到越来越广泛的应用：①医药工业，用于生产抗生素、维生素等常用药物和人胰岛素、乙肝疫苗、干扰素、透明质酸等新药；②食品工业，用于微生物蛋白、氨基酸、新糖源、饮料、酒类和一些食品添加剂(柠檬酸、乳酸、天然色素等)的生产；③能源工业，通过微生物发酵，可将绿色植物的秸秆、木屑以及工农业生产中的纤维素、半纤维素、木质素等废弃物转化为液体或气体燃料(酒精或沼气)，还可利用微生物采油、产氢以及制成微生物电池；④化学工业，用于生产可降解的生物塑料、化工原料(乙醇、丙酮、丁醇、癸二酸等)和一些生物表面活性剂及生物凝集剂；⑤冶金工业，微生物可用于黄金开采和铜、铀等金属的浸提；⑥农业，用于生物固氮和生产生物杀虫剂及微生物饲料，为农业和畜牧业的增产发挥了巨大作用；⑦环境保护，可用微生物来净化有毒的高分子化合物，降解海上浮油，清除有毒气体和恶臭物质以及处理有机废水、废渣等等。4微生物发酵过程微生物发酵过程即微生物反应过程，是指由微生物在生长繁殖过程中所引起的牛化反应的过程。根据微生物的种类不同(好氧、厌氧、兼性厌氧)，微生物发酵过程可以分为好氧性发酵过程和厌氧性发酵过程两大类。(1)好氧性发酵在发酵过程中需要不断地通人一定量的无菌空气，如利用黑曲霉进行的柠檬酸发酵，利用棒状杆菌进行的谷氨酸发酵，利用黄单孢菌进行的多糖发酵等。(2)厌氧性发酵在发酵时不需要供给空气，如乳酸杆菌引起的乳酸发酵，梭状芽孢杆菌引起的丙酮、丁醇发酵等。此外，酵母菌是兼性厌氧微生物，它在缺氧条件下进行厌氧性发酵积累酒精而在有氧即通气条件下则进行好氧性发酵，大量繁殖菌体细胞，因此称为兼性发酵。根据培养基状态的不同(固体或液体)，微生物发酵可分为固体发酵和液体发酵。如果按照发酵设备来分，又可分为敞口发酵、密闭发酵、浅盘发酵和深层发酵。其中深层发酵法是指在液体培养基内部(不仅仅在表面)进行的微生物培养过程。液体深层发酵是在青霉素等抗生素的生产中发展起来的技术。同其他发酵方法相比，它具有很多优点：①液体悬浮状态是很多微生物的最适生长环境；②在液体中，菌体及营养物、产物(包括热量)易于扩散，使发酵可在均质或拟均质条件下进行，便于控制，易于扩大生产规模；③液体输送方便，易于机械化操作；④厂房面积小，生产效率高，易进行自动化控制，产品质量稳定；⑤产品易于提取、精制等。因而液体深层发酵在发酵工业中被广泛应用。4.1发酵工业中的常用微生物微生物资源非常丰富，广布于土壤、水和空气中，尤以土壤中为多。有的微生物从自然界中分离出来就能够被利用，有的需要对分离到的野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。当前发酵工业所用菌种的总趋势是从野生菌转向变异菌，从自然选育转向代谢控制育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。发酵工业生产上常用的微生物主要是细菌、放线菌、酵母菌和霉菌，由于发酵工程本身的发展以及遗传工程的介入，藻类、病毒等也正在逐步地成为发酵工业中采用的微生物。4.2培养基4.2.1培养基的种类培养基是人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物需要的多种营养物质的混合物。培养基的成分和配比，对微生物的生长、发育、代谢及产物积累，甚至对发酵工业的生产工艺都有很大的影响。依据其在生产中的用途，可将培养基分成孢子培养基、种子培养基和发酵培养基等。4.2.2发酵培养基的组成发酵培养基的组成和配比由于菌种不同、设备和工艺不同以及原料来源和质量不同而有所差别。因此，需要根据不同要求考虑所用培养基的成分与配比。但是综合所用培养基的营养成分，不外乎是碳源(包括用作消泡剂的油类)、氮源、无机盐类(包括微量元素)、生长因子等几类。4.2.3菌种在进行发酵生产之前，必须从自然界分离得到能产生所需产物的菌种，并经分离、纯化及选育后或是经基因工程改造后“工程菌”，才能供给发酵使用。为了能保持和获得稳定的高产菌株，还需要定期进行菌种纯化和育种，筛选出高产量和高质量的优良菌株。4.2.4种子扩大培养将保存在砂土管、冷冻干燥管或冰箱中处于休眠状态的生产菌种接人试管斜面培养基上活化后，再经过茄子瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，获得一定数量和质量的纯种，这个全过程称为种子扩大培养，这些纯种培养物称为种子。发酵产物的产量与成品的质量，与菌种性能以及孢子和种子的制备情况密切相关。先将储存的菌种进行生长繁殖，以获得良好的孢子，再用所得的孢子制备足够量的菌丝体，供发酵罐发酵使用。种子制备有不同的方式，有的从摇瓶培养开始，将所得摇瓶种子液接人到种子罐进行逐级扩大培养，称为菌丝进罐培养；有的将孢子直接接人种子罐进行扩大培养，称为孢子进罐培养。采用哪种方式和多少培养级数，取决于菌种的性质、生产规模的大小和生产工艺的特点。种子制备一般使用种子罐，扩大培养级数通常为二级。对于不产孢子的菌种，经试管培养直接得到菌体，再经摇瓶培养后即可作为种子罐种子。4.2.5发酵发酵是在无菌状态下对微生物进行纯种培养，本阶段微生物合成大量的产物是整个发酵工程的中心环节。因此，所用的培养基和培养设备都必须经过灭菌，通人的空气或中途的补料都是无菌的，转移种子也要采用无菌接种技术。通常利用饱和蒸汽对培养基进行灭菌，灭菌条件是在120℃(约0．1MPa表压)维持20～30min。空气除菌则采用介质过滤的方法，可用定期灭菌的干燥介质来阻截流过的空气中所含的微生物，从而制得无菌空气。发酵罐内部的代谢变化(菌丝形态、菌浓度、糖含量、氮含量、pH、溶氧浓度和产物浓度等)是比较复杂的，特别是次级代谢产物发酵就更为复杂，受许多因素控制。4.2.6下游处理发酵结束后，要对发酵液或微生物细胞进行分离和提取精制，将发酵产物制成符合要求的成品。5液体深层发酵5.1发酵的操作方式根据操作方式的不同，液体深层发酵主要有分批发酵、连续发酵和补料分批发酵三种类型。5.2分批发酵营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放罐，中间除了空气进入和尾气排出，与外部没有物料交换。传统的生物产品发酵多用此过程，它除了控制温度和pH及通气以外，不进行任何其他控制，操作简单。但从细胞所处的环境来看，则有明显改变，发酵初期营养物过多，可能抑制微生物的生长，而发酵的中后期又可能因为营养物减少而降低培养效率；从细胞的增殖来说，初期细胞浓度低，增长慢，后期细胞浓度虽高，但营养物浓度过低也生长不快，总的生产能力不是很高。迄今为止，分批发酵仍是常用的发酵方法，广泛用于多种发酵过程。5.3连续发酵所谓连续发酵，是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定，微生物在稳定状态下生长。稳定状态可以有效地延长分批培养中的对数期。在稳定的状态下，微生物所处的环境条件，如营养物浓度、产物浓度、pH等都能保持相对恒定，微生物细胞的浓度及其比生长速率也可维持不变，甚至还可以根据需要来调节生长速度。与分批发酵相比，连续发酵有着较多优点，但目前主要用于研究工作中，如发酵动力学参数的测定，过程条件的优化试验等。而在工业生产中的应用还不多，目前主要用于面包酵母和饲料酵母的生产，以及有机废水的活性污泥处理等。另外，酒精连续发酵生产技术在前苏联也已获得成功的应用。而新近发展的一种培养方法则是把固定化细胞技术和连续培养方法结合起来，用于生产丙酮、丁醇、正丁醇、异丙醇等重要工业溶剂。5.4补料分批发酵补料分批发酵又称半连续发酵，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术，是指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术。通过向培养系统中补充物料，可以使培养液中的营养物浓度较长时间地保持在一定范围内，既保证微生物的生长需要，又不造成不利影响，从而达到提高产率的目的。补料在发酵过程中的应用，是发酵技术上一个划时代的进步。补料技术本身也由少次多量、少量多次，逐步改为流加，近年又实现了流加补料的微机控制。但是，发酵过程中的补料量或补料率，目前在生产中还只是凭经验确定，或者根据一、两个一次检测的静态参数(如基质残留量