全自动生化分析仪的常用检测方法

生化分析仪的常用检测方法董苹2010-8内容•一概述•二基本原理终点法•三检测方法固定时间法连续监测法功能特点•特点：自动化——机械化的仪器设备模仿代替手工操作•优点：提高了工作效率减少了主观误差•灵敏准确快速标准化分类管道连续流动式•按结构原理分分立式——常用离心式干片式——急诊常用小型•按测定速度分中型大型超大型（模块式）•按自动化程度分半自动全自动主要构成•加样系统（样品转盘试剂仓取样装置）•比色系统（光源比色杯单色器检测器）•供排水系统•数据处理系统内容•一概述•二基本原理终点法•三检测方法固定时间法连续监测法基本原理•临床生化分析仪最常使用的是——分光光度法•分光光度法——是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。分光光度计组成光源样品池单色器检测器记录装置光吸收曲线•溶液对不同波长光的吸收程度，通常用光吸收曲线来描述。讨论•不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似λmax不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax则不同。•不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度A不同，在λmax处吸光度A的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。在分光光度法中,以______为纵坐标,以____为横坐标作图可得光吸收曲线。浓度不同的同种溶液,在该种曲线中其最大吸收波长_______，相应的吸光度大小则_______，同一波长下摩尔吸数。波长不同相同吸光度相同Lamber-Beer定律：吸收光谱法基本定律描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系Lamber定律：A∝lBeer定律：A∝C入射光强度I0透射光强度I物体截面为S厚度为lLambert-Beer（朗伯-比尔）定律•当一束平行单色光通过均匀的非散射样品时，样品对光的吸光度与样品的浓度及厚度成正比•A=kcb•A---吸光度k---吸光系数c---溶液浓度b---液层厚度吸光度•透光度的负对数表示物质对光的吸收程度A=-lgT=lg1/T=lgI0/ItT---透光度I0--入射光强度It--透射光强度T=It/I0吸光系数•定义：吸光物质在单位浓度及单位厚度时测得的吸光度。•K值的大小取决于吸光物质的性质、入射光波长、溶液温度和溶剂性质等，与溶液浓度大小和液层厚度无关。但K值大小因溶液浓度所采用的单位的不同而异。吸光系数•三种表现形式：摩尔吸光系数ε吸光系数a百分吸光系数E1%1cmLambert-Beer（朗伯-比尔）定律•郎伯-比尔定律表明：当液层厚度固定时，溶液的吸光度与溶液的浓度成正比。即：A/C=const•故：只要测出某种溶液的吸光度，将它与已知浓度的标准溶液吸光度进行比较，就可以算出该溶液的浓度。讨论：1.Lamber-Beer定律的适用条件（前提）:入射光为单色光溶液是均匀，无散射溶液2.该定律适用于固体、液体和气体样品3.在同一波长下，各组分吸光度具有加和性如果溶液中同时存在两种或两种以上的吸光性物质,则测得的该溶液的吸光度等于溶液中各吸光性物质吸光度的总和，即：A（a+b+c）＝Aa＋Ab＋Ac应用：多组分测定偏离Beer定律的因素•依据Beer定律,A与C关系应为经过原点的直线•偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面：（一）光学因素（二）化学因素（一）光学因素1．非单色光的影响：Beer定律应用的重前提—入射光为单色光•照射物质的光经单色器分光后并非真正单色光•其波长宽度由入射狭缝的宽度和棱镜或光栅的分辨率决定•为了保证透过光对检测器的响应，必须保证一定的狭缝宽度•这就使分离出来的光具一定的谱带宽度讨论入射光的谱带宽度严重影响吸光系数和吸收光谱形状E1＝E2A=E1C·LE1≠E2A与C不成线性关系，偏离Beer定律（E2-E1)↑A与C偏离线性关系越严重结论：●选择较纯单色光（Δλ↓，单色性↑）●选λmax作为测定波长（一）光学因素2.杂散光的影响杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远。杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变值。（一）光学因素3．反射光和散色光的影响：反射光和散色光均是入射光谱带宽度内的光直接对T产生影响。散射和反射使T↓，A↑，吸收光谱变形注：一般可用空白对比校正消除4．非平行光的影响：使光程↑，A↑，吸收光谱变形（二）化学因素•溶液中的溶质可因c的改变而有离解、缔合、配位以及与溶剂间的作用等原因而发生偏离L-B定律的现象。•例：在水溶液中，Cr(Ⅵ)的两种离子存在如下平衡•Cr2O42-+H2O⇌2CrO42-+2H+定量分析方法•(1)标准曲线法•(2)标准溶液对比法（外标一点法）•(3)吸光系数法标准曲线法——最经典方法•前提：固定仪器和固定条件•过程：配置标准溶液系列分别测定A得C~A曲线样品测定A样查得C样CABCKA标准曲线法标准溶液对比法在相同的条件下，配制浓度为cs的标准溶液和浓度为cx的试样溶液，在最大吸收波长处，分别测定二者的吸光度值为As、Ax，依据朗伯-比尔定律得:As=KbcsAx=Kbcx则:cx=cs*Ax/As标准溶液对比法sCiCC吸光系数法吸光系数法又称绝对法，是直接利用朗伯-比尔定律的数学表达式A＝Kbc进行计算的定量分析方法。在手册中查出待测物质在最大吸收波长处的吸光系数或,并在相同条件下测量样品溶液的吸光度A，则其浓度为：或AcLLEA%1cm1max%1cm1E内容•一概述•二基本原理终点法•三检测方法固定时间法连续监测法终点法•终点法——通过检测终点吸光度的改变大小来求出被测物含量。•何为终点？如何判断？•通常在反应终点附近连续选择两个吸光度值，求其平均值，根据两点的差值来判断反应终点。终点法•终点时间的确认：•一、根据时间-吸光度曲线如:Trinder反应测尿酸，反应曲线上3-5分钟时其A趋向稳定,故可将5分钟作为反应终点。•二、根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定如:溴甲酚绿法测血清白蛋白分类•终点法：一点终点法二点终点法免疫比浊法双波长法一点终点法•一点终点法——在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时，选择一个时间点测定吸光度值。•通常在反应终点附近连续读两个吸光度，求出两点的平均值，并根据两点的差值判断反应是否达到平衡。一点终点法的设置：•以R和S混合之前的空气空白、水空白或试剂空白的吸光度值为测定计算基点，以反应达到平衡的吸光度读数减去空白读数，校准曲线通过零点且成直线，对于反应速度快的多用。如：GLUTGCH等2019/10/2637AlT（时间）AS+R(吸光度）一点终点法反应曲线•计算公式：C=(Am-Ab)*KAm----终点读数点的吸光度Ab----试剂空白吸光度K----校正系数二点终点法•第二试剂加入以前，选择某一点读取吸光度Am，经过一定时间后反应达终点后测第二个吸光度值An,利用两吸光度之差计算结果。•第一点吸光度值由样本本身或第一试剂与样品的非特异性反应有关，相当于样品空白，可有效的消除样品自身的吸光度，如溶血，黄疸，脂血等的干扰。2019/10/2640AnTAR2AmS+R1(吸光度）（时间）两点终点Ax=样本空白An-k0Am（体积校正因子）k0=Sv+RlSv+R1+R2两点终点法•计算公式：C=(An-K0*Am)*KK0---体积校正因子K0=(Sv+R1)/(Sv+R1+R2)免疫比浊法通过物质对光的散射或透射来测定物质含量的方法：散射比浊：特定蛋白分析仪透射比浊：自动生化分析仪通常作两点终点法分析，多采用多点校准。应用：用Ab测定Ag（主要为微量蛋白：IG、C、APOA1/B、ASO、RF、CRP等），要求Ab过量，此时Ag-Ab复合物的生成量随Ag的增加而递增，光散/透射射强度与抗原量成正比。免疫比浊法•优点：方法简便结果准确可用于自动化仪器检测•缺点：抗体用量大达平衡时间长双波长法消除样品中对测定有干扰的物质的影响；•在试样中含有两个组分a和b时，若要测定组分b,组分a有干扰，应设法消除组分a的吸收干扰。首先选择待测组分b的最大吸收波长λ1作为测量波长，然后用作图的方法选择参比波长λ2，使组分a在这两个波长处的吸光度相等。双波长法•试样溶液在λ2和λ1两个波长处的吸光度之差，只与待测组分的浓度成正比，而与干扰组分的浓度无关干扰物质1.脂血：吸收光谱300～600nm呈下降趋势2.Hb：350nm、400nm、540nm、580nm吸收峰3.胆红素：300～500nm有吸收峰可见它们的吸收峰都较宽，且同测定波长有重叠现象。双波长法•主波长的选择•反应体系中待测组分吸收峰对应的波长，尽量避开或减少来自试剂空白和样本空白对测定组分的干扰，提高特异性和灵敏度。双波长法•辅助波长的选择：根据测定波长选择辅助波长，要求干扰物质在测定波长同辅助波长有相同的吸光度，待测物吸光度差异很大。如:钼酸铵法测P3＋用340nm，而Hb在340及380nm均有较高吸收峰，选380nm作为辅助波长。双波长法•双波长测定优点：①消除噪音干扰②减少杂散光影响③减少样品本身光吸收的干扰固定时间法•指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，这两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，利用这两点吸光度差值计算结果。如：苦味酸法测肌酐固定时间法•计算公式：C=(A2-A1)*K·●●A1A2T(吸光度）连续监测法•根据反应速度与待测物的浓度成正比，通过测定一段时间内吸光度的变化速率（△A/min）来计算待测物的浓度。•酶活性测定常用酶促反应曲线连续监测法零级反应期---酶促反应速度达到并保持恒定速率进行反应，单位时间内的变化速率恒定不变。在零级反应期单位时间内的吸光度变化(反应速率△A/min)与酶活力呈正比。连续监测法•测定时间的选择：监测时间应根据所用仪器不影响检测速度和结果的准确性选在时间反应进程曲线的线性期。通常：延迟时间：30-60秒监测时间：120秒1.连续监测法•即零级反应速率法,亦称斜率法在较长反应时间区段内(90-180秒)，每隔一定时间(5~30秒)读取一次吸光度值，至少读取4点，得到3个以上△A，最后算出反应速率△A/min。uTuuuVVltALU610/2019/10/2658AlTAS+R1R2A2(吸光度）（时间）速率法A/min=[(A2-A1)-(空白)]/(t2-t1)1.连续监测法特点•与固定时间法相比，属于即时观测，无需停止酶促反应、不需添加其他呈色试剂，且可将多点的测定结果绘图连线，快速、直观查看酶促反应进程，很容易找到呈直线的线性期，检查到是否偏离零级反应。2.两点速率法主要用于其反应过程不成线性，这样只注意其反应的起始点和终止点，而忽视其中间过程的线性变化。如：测定苦味酸法测Cr，反应过程中VitC、丙酮酸、蛋白质等均可与苦味酸生成红色化合物而干扰反应，通常选择1min内的两点进行测定。A2TAS+R1A1R2(吸光度）（时间）两点速率法Ax=A2-A1tt两点速率法•缺点：人为确定t1、t2，不定因素较多，不能保证反应在t1-t2期间呈线性，影响结果准确性。•优点：方法简单；酶活力较低、测定吸光度值较小时，可增加测定时间段而不受仪器连续监测时间点的局限，减少读数误差。3.速率B法•在一个通道内一次进行两项反应相关的速率法测定•利用仪器的微机自动处理，在第一反应(干扰反应)一直维持线性的前提下，可以从第二反应(主反应)速率中扣除第一反应速率的延续影响。•如用于消除胆红素转化为胆绿素吸光度下降、对肌酐苦味酸法测定的负干扰等。AT试验1试验2LMDNP红线2红线1ALMANP