中国药科大学-药物分析课件(第六版)-第十一章-抗生素类药物分析

第十一章抗生素类药物的分析中国药科大学药学院药分教研室中国药科大学药学院药分教研室在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称β–内酰胺类氨基糖苷类四环素类大环内酯类多烯大环类多肽类1.抗生素（antibiotics）2.分类中国药科大学药学院药分教研室一、概述化学纯度较低活性组分易发生变异稳定性差3.来源4.抗生素的特点化学合成半合成生物合成（发酵）生产工艺复杂发酵过程不易控制，易受污染原因中国药科大学药学院药分教研室一、概述采用生物学法与物理化学法鉴别：理化方法、微生物法检查：水分、异常毒性、热原、细菌内毒素、降压物质等含量/效价测定：微生物法：与临床疗效吻合，灵敏度高，但操作复杂费时；理化方法：准确度与专属性较高，且操作简便，但与临床疗效有偏差5.抗生素质量分析一、概述中国药科大学药学院药分教研室1.化学结构包括青霉素类和头孢菌素类青霉素类：6-APA为母核头孢菌素类：7-ACA为母核中国药科大学药学院药分教研室二、β–内酰胺类酸性较强（pKa2.5-2.8）临床常用其碱金属盐（水溶性好）酸性(羧基)有多个手性碳旋光性青霉素类：苯环取代基头孢菌素类：母核有共轭结构UV（共轭）干燥条件较稳定，溶液不稳定稳定性(内酰胺)2、主要理化性质降解失效氧化剂、酸、碱酶、金属离子、Δ青霉素中国药科大学药学院药分教研室二、β–内酰胺类2、主要理化性质中国药科大学药学院药分教研室二、β–内酰胺类1）羟肟酸铁反应：β–内酰胺类羟肟酸显色2）茚三酮反应α-氨基蓝紫色3）双缩脲反应β–内酰胺类紫色4）光谱法（UV、NMR）5）色谱法（HPLC、TLC）NH2OH·HClNaOHFe3+H+茚三酮Δ碱性酒石酸铜呈色反应3、鉴别中国药科大学药学院药分教研室二、β–内酰胺类3、鉴别-------------头孢利定的NMR鉴别法(JP14)NMR鉴别法单峰信号取本品50mg溶于0.5ml重水中，测定NMR光谱时，应显示多重峰信号多重峰信号δ=3.8附近δ=6.9～7.5δ=7.9～9.0235强度比中国药科大学药学院药分教研室二、β–内酰胺类3、鉴别-------------头孢氨苄鉴别的TLC条件CHP（2000）5mg/ml2µl硅胶G0.1mol/L枸橼酸液-0.2mol/LNa2HPO4-丙酮(120:80:3)0.1%茚三酮溶液显色USP（24）25mg/ml5µl硅胶醋酸乙酯-水-乙腈-冰HAc(48:18:14:14)短波长UV光检出BP（1999）0.4%(W/V)1µl硅烷化硅胶HF25415.4%NH4Ac(pH6.2)-丙酮(85:15)254nm检出中国药科大学药学院药分教研室二、β–内酰胺类4、特殊杂质检查--------------聚合物、有关物质、异构体等色谱条件与系统适用性试验测定法头孢他啶中聚合物测定头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查色谱条件与系统适用性试验异构体和有关物质举例：中国药科大学药学院药分教研室二、β–内酰胺类头孢他啶中聚合物测定-----------色谱条件与系统适用性试验葡聚糖凝胶G-10理论板数应不低于900，拖尾因子在0.75～1.5254nm检测流动相A：含3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液蓝色葡聚糖2000中国药科大学药学院药分教研室头孢他啶中聚合物测定-----------色谱条件与系统适用性试验葡聚糖凝胶G-10峰面积的RSD应小于5.0%254nm检测流动相B：0.01%十二烷基硫酸钠溶液头孢他啶对照品溶液中国药科大学药学院药分教研室头孢他啶中聚合物测定-----------测定法葡聚糖凝胶G-10254nm检测流动相A：含3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液头孢他啶样品（20mg/ml）外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过0.3%AS中国药科大学药学院药分教研室头孢他啶中聚合物测定-----------测定法葡聚糖凝胶G-10254nm检测流动相B：0.01%十二烷基硫酸钠溶液头孢他啶对照品溶液AR外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过0.3%中国药科大学药学院药分教研室头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查头孢呋辛酯A，B异构体之间、头孢呋辛酯A异构体与头孢呋辛酯△2-异构体之间的分离度应大于1.5；色谱条件：ODS分析柱；0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:38）为流动相；流速1ml/min；检测波长278nm。系统适用性试验：理论板数按头孢呋辛酯A异构体峰计算，应不低于1500。中国药科大学药学院药分教研室40020600302010时间(min)峰高(mAU)654A异构体B异构体113.95411.9192.401B异构体峰的相对保留时间约为0.85，A异构体峰的相对保留时间为1.0。供试品色谱图中,A异构体峰的面积与A、B异构体峰的面积和之比应为0.48～0.55。头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查中国药科大学药学院药分教研室异构体供试品溶液：0.2mg/ml(流动相溶）对照溶液:供试品溶液，加流动相稀释成6g/ml对照溶液进样20l，调节仪器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的10%取供试品溶液和对照品溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的2.5倍供试品溶液如显杂质峰，量取各杂质峰面积的和，不得大于对照溶液主峰的面积中国药科大学药学院药分教研室头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查有关物质5、含量测定-----------碘量法（ChP2000）二、β–内酰胺类中国药科大学药学院药分教研室原理：青霉素与头孢菌素本身不与碘反应，但其碱性降解产物可消耗碘青霉素族头孢菌素族NaOH水解4I2H+8I-I2+2Na2S2O32NaI+Na2S4O6定量过量剩余5、含量测定-----------碘量法（ChP2000）中国药科大学药学院药分教研室反应分两步进行：水解反应(按化学计算量进行)氧化-还原反应(无定量关系，受温度、pH值和时间等因素影响，应严格控制反应条件并采用标准品平行对照测定)5、含量测定-----------碘量法（ChP2000）中国药科大学药学院药分教研室因样品中杂质会消耗碘，故应作空白试验。加入样品，不加碱；其余试剂（醋酸盐缓冲液，碘液，硫代硫酸钠）都要加碱。空白试验:空白试验与经典空白试验不同：5、含量测定-----------碘量法（ChP2000）中国药科大学药学院药分教研室试验条件:（I2氧化）弱酸性（pH4.5）20分钟后，耗碘量随时间的变化较小碱↑I2→IO3-+I-酸↑某些药物与碘生成复盐沉淀温度（24～26℃）温度＞38℃时未水解的供试品亦消耗碘反应时间：（20分钟）5、含量测定-----------碘量法（ChP2000）中国药科大学药学院药分教研室含量％＝××对照品％V样空-V样W对V对空-V对W样灵敏度高：样品:碘=1:8反应条件、实验操作要求高1份含量V对、V对空V样、V样空加试剂次序、反应时间、滴定速度相同特点：5、含量测定-----------电位配位滴定法（汞量法）中国药科大学药学院药分教研室原理：青霉素不与汞盐反应，其碱性降解产物可与Hg2+络和。Hg++2R-SH(RS)2Hg+2H+Hg2+OOHHRHHCNCCCSCONHCHCCOOHCH3CH3ROHHHCSCONHCCOOHCH3CH3HNCHg2+OHHCHCONHHOOCROCSCH3CH3CNHHg2+O方法说明：a、空白试验与碘量法类似，加样品，不加NaOHb、与碘量法相比，汞量法不需对照试验5、含量测定-----------其他常用方法中国药科大学药学院药分教研室酸碱滴定法：应用广泛硫醇汞盐法羟肟酸比色法HPLC法：应用广泛咪唑HgCl2（λmax324～345nm）青霉素青霉烯酸硫醇汞盐NH2OHH+Fe3+β–内酰胺类红色5、含量测定（例）-----------阿莫西林克拉维酸钾片中国药科大学药学院药分教研室填充剂流动相检测波长峰形阿莫西林峰与克拉维酸峰的分离度应大于3.5色谱条件与系统适用性试验十八烷基硅烷键合硅胶磷酸盐缓冲液-甲醇(95:5)流速为0.7ml/min；检测波长为220nm5、含量测定（例）-----------阿莫西林克拉维酸钾片中国药科大学药学院药分教研室取本品10片，置1000ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿莫西林对照品与克拉维酸对照品各适量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林0.5mg和克拉维酸0.25mg的混合溶液，同法测定。按外标法以峰面积分别计算供试品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。测定法：中国药科大学药学院药分教研室1.化学结构三、氨基糖苷类都是以氨基环醇与氨基糖缩合而成的苷；分子结构中都含有多羟基；均为碱性抗生素；链霉素中国药科大学药学院药分教研室临床应用其硫酸盐碱性(氨基)（糖）：有多个手性碳旋光性(糖)水溶性溶解度(氨基、羟基)强酸、碱条件均可水解稳定性(苷)2、主要理化性质三、氨基糖苷类中国药科大学药学院药分教研室3、鉴别三、氨基糖苷类茚三酮反应：具羟基胺类，α-氨基酸性质链霉素+水和茚三酮蓝紫色链霉素N-甲基葡萄糖胺N-甲基葡萄糖胺（Elson-Morgan）反应：红色水解对二甲氨基苯甲醛乙酰丙酮OH-NCHONCH3CH3+CH3CH3NCNHCH3CH3HNNCH+H+中国药科大学药学院药分教研室OH-重排Fe3+Fe/3OOCH3OOOCH3OH8-羟基喹啉NaOBrOH-水解坂口（Sakaguchi）反应：(链霉胍特有）麦芽酚（Maltol)反应：(链霉糖特有）三、氨基糖苷类-------鉴别链霉素麦芽酚紫红色链霉素链霉胍橙红硫酸盐反应或α-萘酚中国药科大学药学院药分教研室4、检查-------------来源：发酵中产生BP:薄层色谱法（杂质对照品法）要求：NC2≥2000，C2a峰和C2峰的分离度应符合要求，重复进样RSD2.0%三、氨基糖苷类链霉素中链霉素B的检查庆大霉素C组分测定（系统适用性试验）色谱柱：ODS流动相：H2O-HAc-MeOH配制的庚烷磺酸钠溶液(0.2M)，必要时调节甲醇的含量。检测波长：330nm（邻苯二甲醛柱前衍生）4、含量检测三、氨基糖苷类氨基糖苷类含量检测微生物法、HPLC法等中国药科大学药学院药分教研室中国药科大学药学院药分教研室四、四环素类1.化学结构中国药科大学药学院药分教研室四、四环素类-OH：酸性N(CH3)2：碱性与酸、碱均可成盐临床多用盐酸盐两性旋光性易发生异构化，降解等反应，性质不稳定稳定性酚羟基、烯醇基与Ca2+、Mg2+络合显色与金属离子络合2、主要理化性质UV和荧光中国药科大学药学院药分教研室四、四环素类2.主要理化性质碱性C环开环，形成内酯异四环素弱酸性（pH2-6）A环C-4异构化差向四环素酸性（pH2）C环脱水脱水四环素中国药科大学药学院药分教研室四、四环素类OOHCONH2(CH3)2NOHHOOHCONH2N(CH3)2HOHAApH2.0~6.0差向异构体ROHCH3OHOOHHRCH3OHOOHRCH3OHOHOH2ODDDCBBCBC脱水四环素类ROHCH3OHR'''OOHOOHCONH2NHOHCH3CH3CH3CH3ROHR'''OOOHCONH2NHOHOCH3O异四环素OH-四、四环素类中国药科大学药学院药分教研室中国药科大学药学院药分教研室四、四环素类3.鉴别1）浓硫酸反应2）FeCl3反应：（酚羟基）显红色~褐色3）TLC、HPLC4）荧光：（含共轭双键）紫外灯照射下产生不同颜色荧光ChP、USP：HPLC法JP：比色法4.检查TLC、HPLC法杂质吸收度（降解产物颜色较深）5.含量中国药科大学药学院药分教研室五、高分子杂质的检查内源性：药物自身聚合物来源于生产过程、贮存过程、使用不当外源性：蛋白、多肽、多糖及其与药物的结合物来源于发