Illumina平台测序原理及常见测序文库构建

Illumina平台测序原理及常见测序文库构建目录第一部分：测序测序原理与流程简介文库构建(~6hrs)cBotHiSeq2500MiSeqHiSeq2000HiSeq2500GAIIxMiSeqHCS/RTAICSMSRCASAVABaseSpace1-8samples1-8samplesDNAIllumina测序流程文库构建(~6hrs)cBotHiSeq25001-8samplesMiSeqHiSeq2000HiSeq25001-8samplesGAIIxMiSeqHCS/RTAICSMSRCASAVABaseSpaceDNA文库构建流程片段化DNA末端补平3’加A接头连接PCR高质量DNA文库结构文库构建的目的是在目的DNA片段两端都连接上想要的接头此单链部分与FlowCell表面上P7接头相同此单链部分与FlowCell表面上P5接头相同IndexSequencingPrimer文库构建(~6hrs)cBotHiSeq2500MiSeq1-8samplesHiSeq2000HiSeq25001-8samplesGAIIxMiSeqHCS/RTAICSMSRCASAVABaseSpace测序芯片(FlowCell)简介flowcell是有2个或8个泳道(Lane)的玻璃片，与一元硬币的厚度相当每个泳道(Lane)内的上下两个表面随机的布满了能够与文库两端接头分别互补配对的寡核苷酸(oligos,P7和P5接头)在flowcell上进行cluster簇生成仪器简介单条DNA模板约1000条DNA模板的拷贝cBotHiSeqSequenncceerr35个循环的桥式PCRcBot工作流程DNA文库变性：使用NaOH将双链DNA文库变性为单链模板链杂交：将单链DNA模板杂交到FlowCell上第一链合成：以FlowCell表面上的oligos为引物，合成第一链桥式PCR：冲走单链DNA模板，以合成的第一链为模板进行35循环的桥式PCR线性化：将与P5接头连接的DNA链从FlowCell上去除阻断3’–OH：防止在后续测序过程中继续延伸DNA链杂交测序引物DNA模板杂交和一链合成接头序列5’-3’延伸含有P7和P5两种接头的FlowCell表面单链DNA分子与FlowCell表面的对应接头杂交以杂交的单链DNA为模板，FlowCell上的接头为引物，合成第一链新合成的链原始模板链双链DNA变性丢弃原始模板链模板链被冲洗走新合成的链留在FlowCell上桥式PCR扩增单链DNA与FlowCell表面对应接头杂交，形成“桥”以接头为引物进行扩增桥式PCR扩增变性变性双链的“桥”得到与FlowCell相连的两条互补的单链DNA分子第二轮桥式PCR扩增完成桥式PCR扩增完成28循环的桥式PCR线性化双链“桥”变性为单链红色箭头为P5接头上的切割位点线性化切割并冲走与P5接头相连的那条DNA链阻断阻断3’–OH杂交Read1引物Read1测序引物将测序引物杂交到文库的接头上Illumina测序流程HiSeq2000HiSeq2500GAIIxMiSeqHCS/RTAICSMSRCASAVABaseSpace文库构建(~6hrs)cBotHiSeq25001-8samplesMiSeq1-8samples进行Read1测序杂交Index测序引物，进行Index测序PairedEndTurnround，合成Read1互补链杂交Read2测序引物，进行Read2测序HiSeqSBS测序流程HiSeqSBS测序流程123PairedEndTurnaroundSequencingBySynthesis，SBS测序原理4种Fl-NTP’s+聚合酶拍照，收集信号去阻断，切除荧光基团X36-151可逆终止化学反应•一次加入4种修饰的dNTP(可逆终止子)•准确度高•可以得到同聚物序列•合成•照相，收集信号•去阻断，切除荧光基团下一个碱基合成100MicronsClusters已完成测序合成的片段Blocked3’-ends变性掉已完成测序合成的片段恢复被阻断的3’–OHPairedEndTurnround形成的桥5’-3’延伸桥式PCR5’-3’延伸PairedEndTurnround形成的双链的桥PairedEndTurnround模板链PairedEndTurnround等温变性，完成15轮桥式PCR后，进行线性化，将模板链切除，保留新合成的子链新合成的链3’-OH阻断Read2测序引物PairedEndTurnround线性化，3’-OH阻断杂交Read2测序引物SequencingBySynthesis2ndReadX36-1514种Fl-NTP’s+聚合酶拍照，收集信号去阻断，切除荧光基团Illumina测序流程HCS/RTAICSMSRCASAVABaseSpace文库构建(~6hrs)cBotHiSeq25001-8samplesMiSeqHiSeq2000HiSeq25001-8samplesGAIIxMiSeq第二部分：常见文库构建流程简介文库分类DNA类文库•DNA小片段文库•DNA大片段文库•Exon文库•PCR-Free文库•简化基因组文库、单细胞样本文库等RNA类文库•转录组文库•表达谱（RNA-Seq）•SmallRNADNA小片段文库•DNA小片段文库•片段大小在1Kb以下的普通DNA文库（200bp,350bp,500bp…）•DNA小片段文库可用来进行人重测序，动植物、微生物的denovo和重测序，16srRNA测序，宏基因组测序等项目类型的文库构建。DNA小片段建库流程DNA小片段建库流程DNA小片段建库流程DNA小片段建库流程DNA大片段文库•DNA大片段文库，又名末端配对（mate-paired）文库•片段长度大于1Kbp。•主要用于动植物，微生物的denovo测序DNA大片段文库建库流程DNA大片段文库建库流程为什么要建大片段文库Exon文库•人类外显子组总共约30Mb，占全部人类基因组约1%。•外显子具有高度的保守型，且大部分疾病的致病位点位于外显子区。•外显子测序是指利用序列捕获技术将外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。•Exon文库主要用于人全外显子测序和目标区域测序Exon文库流程外显子捕获方式•液相杂交•液相杂交是通过在溶液中，利用链碱基配对的原理，将DNA片段与探针杂交，然后洗脱，富集目的片段。Exon测序特点•优点：•1、与全基因组测序相比，外显子测序具有测序覆盖度更深、数据准确性更高、花费成本更低等优势，对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势。•不足：•1、与全基因组测序相比，不能检测到基因组内较大的结构性变异。•2、与转录组测序相比，不能检测到新的基因。PCR-Free文库•PCR-Free文库，顾名思义，就是在文库构建过程中不需要进行PCR的文库。•主要是针对一些特殊样本，比如GC含量高，PCR扩增困难的样本；PCR产物。•不足：所需的样本起始量较多。PCR-Free文库与普通文库比较简化基因组(RAD-seq)文库•RAD-seq即基于酶切的简化基因组测序技术，是指利用限制性内切酶对基因组进行酶切，结合一定大小的插入片段文库，对其进行高通量测序，快速鉴定高准确性的变异标记（SNPs）信息的技术•与传统技术相比，该类技术操作简单、不受参考基因组限制、可简化复杂基因组；另外，基于SNPs的分子标记技术性价比高，稳定性好，在基因组中分布更加广泛，特别是适合大样本量的分析。简化基因组文库建库流程转录组文库真核生物原核生物总RNA利用Oligo(dT)富集mRNA去除rRNA随机引物六聚体反转录合成cDNA末端修复，加A，加接头后PCR扩增Illumina测序将mRNA随机打断成~200nt转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有mRNA。应用：转录本的种类和基因定量基因的转录结构可变剪切发现新的转录本链特异性转录组建库•使用ssRNA-seq可以确定转录本是来自正链还是负链。以便更加准确的获得基因的结构以及基因表达信息，并且发现新的基因。•很多基因组区域具有正负链的转录本，反义转录是真核基因的一个特征，是一种重要的调控方式。常规转录组建库方法基础上，在合成第二条cDNA链时，替换dTTP为dUTP，加上接头后降解含dU的DNA单链。链特异性转录组建库均一化（DSN）建库方法：构建常规转录组文库，库检合格后取80-100ng文库进行DSN处理，然后PCR再次出库。目的：减低高丰度表达基因，有效富集低丰度表达基因。DSN酶：双链特异性核酸酶(Duplex-SpecificNuclease,DSN)，能够选择性降解双链DNA和DNA-RNA杂交体中的DNA,由于高丰度的基因形成双链的速度较快，所以降解也比较多。RNA-Seq•是用来研究某一生物对象在特定生物过程中基因表达差异的技术，具有定量准、可重复性高、检测范围宽、成本低等特点。真核生物原核生物总RNA利用Oligo(dT)富集mRNA去除rRNA随机引物六聚体反转录合成cDNA末端修复，加A，加接头后PCR扩增Illumina测序将mRNA随机打断成~200ntRNA-Seq与常规转录组区别RNA-Seq转录组应用用于基因表达丰度检测用于拼接（＞1G数据量）测序类型SE：50+8PE：91+8+91建库方法全程磁珠纯化切胶回收插入片段弥散（主峰250-330）单一条带SmallRNA文库◆18-30nt范围内的RNA◆结构上5’端主要以尿嘧啶开始◆与mRNA的降解、翻译抑制（基因沉默）以及形成异染色质有关◆调控细胞生长、发育、基因转录和翻译等生物过程◆包括siRNA,microRNA和piRNASmallRNA文库建库流程