ITC(等温量热滴定法)

等温滴定量热法（ITC）什么是等温滴定量热法？等温滴定量热法（IsothermalTitrationCalorimetry，简称ITC）¾定义：¾定义：将反应物逐次滴定到含有反应所必须的另一反应物的样品溶液中，ITC测量每次滴定后反应所放出或吸收的热量的门技术ITC测量每次滴定后反应所放出或吸收的热量的一门技术等滴定量热法所得的曲线称为曲线¾等温滴定量热法所测得的曲线称为ITC曲线横坐标：时间t，单位s纵坐标热量Q单位通常μcal/s纵坐标：热量Q，单位：通常μcal/sQ=f(t)GEHealthcare公开技术质料ITC重要概念¾重要概念：滴定溶液（injectant）：反应所需的一种反应物滴定溶液（injectant）：反应所需的种反应物样品溶液（sample）：反应所需的另一种反应物¾反应过程的热量的检测：通过测量使样品池和参比物池达到等温状态（∆T~0）所需的功率变化来实现化来实现GEHealthcare公开技术质料ITC可检测哪些反应？¾主要用于检测结合反应的热效应¾引起结合反应的可能作用包括：¾引起结合反应的可能作用包括：①范德华作用②疏水作用②疏水作用③氢键④…④¾广泛应用于生物化学、生物物理等研究领域GEHealthcare公开技术质料ITC分析仪MicroCalVP-ITCMicroCalAutoITCMicroCalAuto-ITC200MiClITCMicroCalITC200GEHealthcare公开技术质料ITC分析仪的基本结构ITC样品池VPITC14LITC的滴定示意图VP-ITC：1.4mLITC200：200μLITC200的基本结构示意图ITC200的滴定示意图GEHealthcare公开技术质料ITC分析仪的可用工作条件•VP-ITC与ITC200的适用温度范围：2-80℃280℃•样品池最大容积：VPITC：14mLVP-ITC：1.4mLITC200：200μL微量注射器最大容积•微量注射器最大容积：ITC200：40μL单次最小注射量•单次最小注射量：ITC200：0.1μL•响应时间：ITC200：10sGEHealthcare公开技术质料ITC实验实1将参与反应的种反应物配制成溶液1.将参与反应的一种反应物配制成溶液，加入样品池（samplecell）2将参与反应的另一种反应物配制成溶液，2.将参与反应的另种反应物配制成溶液，作为滴定液（injectant），加入微量注射器（syringe）3.在程序控制下，按同等时间间隔，自动将滴定液逐次等量地滴定到样品池4每次滴定所产生的反应热效应被ITC检4.每次滴定所产生的反应热效应被ITC检测到，显示为一个吸热或放热峰GEHealthcare公开技术质料ITC实验原始数据积分结果原始数据积分结果•原始数据：显示随着滴定进行，补偿加热丝补偿给样品池和参比池的热量速率差•积分结果：将每次滴加所产生的热流差对时间进行积分，并以在对应时间点样品池内反应物反应物的摩尔比为横轴池内反应物反应物的摩尔比为横轴实线为最佳拟合曲线ITC分析法能提供哪些信息？¾可直接测量反应过程的热效应¾为反应热力学提供定量分析：¾为反应热力学提供定量分析：①结合常数（KD）②反应的化学计量比（n）②反应的化学计量比（）③反应引起的焓变（∆H）④反应引起的熵变（∆S）帮助定性判断起结合应的非价键结合力的特征¾帮助定性判断引起结合反应的非共价键结合力的特征：①范德华作用②疏水作用②疏水作用③氢键…GEHealthcare公开技术质料ITC分析法能提供哪些信息？¾通过采用某种适合的模型，进行非线性最小方差曲线拟合（Non-linearLeastSquaresCurveFitting），可定量分析结合常数（K）、反应的化学计量比（n）、结合焓变∆H¾例如，对一个简单的1:1结合反应式中，结合物的总浓度[Xt]–结合物的总浓度[Mt]–被结合物（即试样）的总浓度V0–样品池的有效体积dQ–在滴定过程中，每个滴定点对应的热量变化K–结合常数n–每个试样分子的结合位点个数GEHealthcare公开技术质料每个试样分子的结合位点个数ITC分析法能提供哪些信息？¾可算得反应的吉布斯自由能变化∆Go，∆Go=RTlnK¾反应的熵变∆So∆G=∆H–T∆S∆Go=–RTlnK¾在积分结果图上，∆H影响曲线与y-轴的截距yn影响积分曲线的拐点K与结合位点总浓度n[Mt]影响积分曲线的整体形状K与结合位点总浓度n[Mt]影响积分曲线的整体形状GEHealthcare公开技术质料ITC实验与反应的热力学信息ITC实验ITC曲线ITC曲线积分分析结果配体溶ITC实验ITC曲线ITC曲线积分分析结果液某生物分某生物分子溶液逐次、等量滴加I.反应完成前：每次滴加Æ一个ITC峰随着反应进行，被测分通过将原始ITC曲线积分，可计算：①反应吉布斯自由能（∆G）随着反应进行，被测分子逐步被配体饱和，ITC峰减小II反应完成后：ITC峰稳①反应吉布斯自由能（∆G）②结合常数（KD）③反应的化学计量比（n）④反应焓变（∆H）II.反应完成后：ITC峰稳定，只有稀释热④反应焓变（∆H）⑤反应熵变（∆S）GEHealthcare公开技术质料ITC实验注意事项¾Wisemanc-parameter：表征结合反应的亲和力与ITC实验设计的关系c=n[M]K¾ITC实验数据的积分曲线的形状，包括其与y-轴的截距，都与c-参数相关为了方便确定反应的∆H、K、n宜选择：1c500称为c-valueexperimentalwindow称为p传统的Wiseman等温线ITC曲线分析：反应的结合推动力吉布斯自由能与结合常数相等温：∆G=∆H-T∆S吉布斯自由能（∆G）与结合常数（KD）相同、但结合机理不同的两个结合反应等温：∆G=∆H-T∆S∆G0主要由-T∆S贡献，该反应为熵增推动的结合反应反应为熵增推动的结合反应反应导致熵减小（-T∆S0），反应导致熵减小（-T∆S0），但∆H减小很多，使∆G0反应得以进行，该反应为焓变推动的结合反应）ITC曲线积分结果的结合反应）ITC曲线积分结果GEHealthcare公开技术质料ITC应用举例多肽与B细胞淋巴癌2（bl2）靶蛋白的作用研究多肽与B-细胞淋巴癌-2（bcl-2）靶蛋白的作用研究实验条件：温度：促凋亡多肽BAD-like多肽BAX温度：25ºC样品池：Bcl-2(30μM)注射器：多肽250μM单次注射体积：3μl注射时间：注射时间：6s注射间隔150150sGEHealthcare公开技术质料ITC应用举例多肽与B-细胞淋巴癌-2（bcl-2）靶蛋白的作用研究多肽与B细胞淋巴癌2（bcl2）靶蛋白的作用研究与B-细胞淋巴癌-2（bcl-2）靶蛋白的结合能力，促凋亡多肽BAD-like比BAX强接近6倍。为什么？多肽BAD-like多肽BAX∆H0，∆S0Æ氢键与疏水作用∆H0Æ形成氢键∆S0Æ存在更多构型改变GEHealthcare公开技术质料ITC应用举例抑制剂与碳酸酐酶的作用研究抑制剂与碳酸酐酶的作用研究用ITC，分别测量5种抑制剂与小牛碳酸酐酶（BCA）的作用，所得热力学参数总结如下表所示抑制剂CBS与呋喃苯胺酸（Furosemide）与BCA的结合能力基本一致（KD，∆G）但结合机理是否样？但结合机理是否一样？GEHealthcare公开技术质料ITC应用举例抑制剂与碳酸酐酶的作用研究抑制剂与碳酸酐酶的作用研究用ITC，分别测量5种抑制剂与小牛碳酸酐酶（BCA）的作用，所得热力学参数总结如下表所示与BCA的结合推动力的比较与BCA的结合推动力的比较：CBS：∆H0，氢键&范德华力；-T∆S0，不利于结合的构型变化Fid∆H0T∆S0氢键范德华力疏水作用Furosemide：∆H0，-T∆S0，氢键、范德华力、疏水作用GEHealthcare公开技术质料ITC应用举例药物研发早期阶段对假正面结果的排除药物研发早期阶段对假正面结果的排除筛选能与目标蛋白TP筛选能与目标蛋白TP特异性结合的化合物已知化合物X可与目标蛋白TP特异性结合性结合根据ITC，得KD=4.9μM，n~1与其他实验方法所得结果相吻合与其他实验方法所得结果相吻合因此，化合物X适于进一步研究化合物X与TP的ITC结果GEHealthcare公开技术质料ITC应用举例药物研发早期阶段对假正面结果的排除药物研发早期阶段对假正面结果的排除与TP（左）：化合物Y，是否与目标蛋白TP有特异性结合？KD=120nM,但∆H异常（高出103倍）n=001过低n=0.01过低因此研究Y与BSA作对比与BSA（右）：与BSA（右）：KD，∆H，n均同Y与TP的接近的接与TP与牛血清白蛋白BSA与与牛血清白蛋白ÆY与TP无特异性结合，不适于进一步研究GEHealthcare公开技术质料ITC应用举例评估蛋白产品质量评估蛋白产品质量两个批次的同种蛋白与某一种标准多肽的结合活性比较KD=97nMKD=135nMKD97nMn=1KD135nMn=0.23假设蛋白浓度23μM第1批蛋白产品KD=135nMn=1两次ITC实验2.3μMn=1两次ITC实验：样品池蛋白浓度10μM标准多肽50μM标准多肽0μ第2批次蛋白中活性成分仅~25%GEHealthcare公开技术质料ITC应用举例软凝聚态物理：纳米颗粒（NP）与脂质体（LP）的作用研究软凝聚态物理：纳米颗粒（NP）与脂质体（LP）的作用研究酸性NP+流动相LP碱性NP+凝胶相LPPLshrinkagebound-NPcauseLPgel-fluidNP-PLbindingLPgel-fluidNP-PLbindingProc.Natl.Acad.Sci.USA,2008,105(47),18171–18175