DNA测序概述--非常全

DNA测序技术概述2014年4月2日DNA测序技术简介DNA测序技术的发展DNA测序技术的小结与展望DNA测序简介DNA是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸。这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。对于每个生物体来说，基因组包含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基因组DNA上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的复杂性和多样性，因而在生命科学研究中扮演了十分重要的角色。测序技术最早可以追溯到20世纪50年代，早在1954年就已经出现了关于早期测序技术的报道，直至1977年Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生。此后三十几年的发展中陆续产生了第二代测序技术，这些技术都采用了合成测序法，只是在DNA阵列的排布、DNA簇扩增，以及基于酶的测序生化反应方面存在差异。第一代DNA测序技术三测序方法的原理第二代DNA测序技术三个测序平台的工作原理及操作步骤第三代DNA测序技术单分子测序的特点及应用前景DNA测序技术的历史自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。199820012002200420062007200820092010200020112012第一代DNA测序技术成熟的DNA测序技术始于20世纪70年代中期。1977年Sanger发明了双脱氧链终止法。同一时期,Maxam和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法。20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序的时代。这些技术统称为第一代DNA测序技术。1.链终止法利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸顺序的方法，是由英国剑桥分子生物学实验室的F.Sanger等人于1977年发明的。F.Sanger（1980年诺贝尔奖获得者）（Thechainterminationmethod）双脱氧链终止法原理：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4种dNTP存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，因为双脱氧核苷没有3´-OH，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端,该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷,链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3´端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳,分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后,根据片段3′端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。技术路线与要求制备单链模板↓将单链模板与一小段引物退火↓加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸分别加入少量4种双脱氧核苷酸↓将4种反应产物分别在4条泳道电泳↓根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列A克隆于质粒中DNA→用碱或热变性BM13克隆单链DNAC噬粒克隆DNADPCR产生单链DNAA高酶活B无5’→3´外切酶活性C无3´→5´外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP的3’碳原子连接的是氢原子,不是羟基5ˊPP5ˊ3ˊHOOH3ˊ5ˊPOH3ˊP325ˊ5ˊPOH3ˊHODNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTPddGTPddATPddTTPddCTP制备单链DNA加放射性引物ddGTPddATPddTTPddCTP5ˊ32P-GTCATGTGCTAG5ˊ32PGTCATGTGCTA5ˊ32PGTCATGTGCT5ˊ32PGTCATGTGC5ˊ32PGTCATGTG5ˊ32PGTCATGT5ˊ32PGTCATG5ˊ32PGTCAT5ˊ32PGTCA5ˊ32PGTC5ˊ32PGT5ˊ32PG聚合产物分别在4个泳道电泳从下到上依次读出DNA片段的核苷酸序列1、模板有两类DNA可以用做Sanger法测序的模板：纯单链DNA和经过热变性或碱变性的双链DNA。采用从重组M13噬菌体颗粒中分离得到的单链DNA模板效果最佳。Sanger法DNA测序的试剂2.引物酶促测序反应中利用一个与模板链特定序列互补的合成寡核苷酸作为DNA合成的引物。M13噬菌体重组克隆的通用测序引物一般长15个~29个核苷酸，并可与紧靠M13mpl8噬菌体多克隆位点区的HindⅢ位点或M13mpl9噬菌体多克隆位点区的EcoRⅠ位点的序列互补。这些引物同样也可用于对克隆于pUC质粒的DNA进行‘双链’测序。此外，还有若干家公司出售一些引物，这些引物是为了对通过多种限制酶切位点克隆于不同质粒的靶DNA进行测序而设计的。3、DNA聚合酶通常用于双脱氧法序列测定的有几种不同的酶，其中包括大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的K1enow片段、反转录酶、经过修饰消除了3‘一5’外切酶活性的T7噬菌体DNA聚合酶[测序酶(5equenase)]和测序酶序酶2.0版，以及耐热DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)。（1）大肠杆菌DNA聚合酶Klenow这种酶是最初用以建立Sanger法的酶，也是至今仍然广泛用于DNA序列测定的酶，通常碰到的两个问题是：1)Klenow片段的持续合成能力低；2)这种酶对模板中的同聚核苷酸或其他含牢固二级结构的区域进行复制的效能很低；将聚合反应的温度提高到55℃，可以缓解但并不能彻底解决这一问题。（2）反转录酶尽管日常测序工作并不广泛使用反转录酶，但有时用这个酶来解决一些由于模板DNA中存在A／T或G／C同聚核苷酸区而引起的问题。（3）测序酶(SequenaseTM)是一种经过化学修饰的T7噬菌体DNA聚合酶。该酶原来具有很强的3＇一5＇外切核酸酶活性，经过修饰后，这一活性大部分均被消除。测序酶2.0版完全缺失了3＇一5外切酶活性，极其稳定而且活性要比经化学修饰的测序酶高2倍。测序酶持续合成能力很强，聚合速率很高，具有广泛的耐受性，它是测定长段DNA序列的首选酶。4）TaqDNA聚合酶适用于测定在37℃形成大段稳定二级结构的单链DNA模板序列。这是因为TaqDNA聚合酶在70℃一75℃活性最高，这一温度下即使GC丰富的模板也无法形成二级结构。有人报道，使用TaqDNA聚合酶进行测序，在放射自显影片上得到的连续数百个碱基条带始终清晰如一，表明这种酶的持续合成能力甚佳。4．放射性标记的dNTP[a-32p]dNTP被广泛地应用于DNA测序。然而32P发射的强β粒子造成两个问题。首先由于发生散射，放射自显影片上的条带远比凝胶上的DNA条带更宽、更为扩散，因此将影响到所读取的序列正确性。其次32P的衰变会引起样品中DNA的辐射分解，因此用32P进行标记的测序反应只能保存一两天，否则DNA将被严重破坏以至测序凝胶上模糊不清、真假难辨。[35s]dATP的使用大大缓解了上述两方面的矛盾。由于35S的衰变产生较弱的β粒子，其散射有所减弱，凝胶和放射自显影片之间在分辨率上相差无几，因此可以从一套反应中确切测定数百核苷酸的DNA序列。此外，35S的低能辐射所引起的样品分解比较轻微，因此，测序反应可在‐20℃保存至1周，而分辨率并不下降。通过M13载体获得单链DNA以测序M13噬菌体载体是专为得到单链DNA测序模板而设计的。美国哈佛大学的Maxam和Gilbert于1977年发明的，化学降解法主要用于测定短片段DNA的序列。用化学试剂处理末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割。由此产生的一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳和放射自显影后，直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。2.化学降解法化学降解法技术路线将双链DNA样品变为单链↓每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带↓分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体↓电泳,放射自显影，读取DNA的核苷酸顺序同时完成4组反应，A、G、C、T链终止法：主流技术，易于机械化自动控制。化学降解法：试剂含有毒性。化学降解法的特点重现性好，所用试剂简单，易于掌握；所测长度比Sanger法短一些，对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果较好；序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所生成的拷贝；因此，不会出现误读、可对未克隆的片段、合成的寡核苷酸直接进行测序；5′和3′端均可标记，可从两方向测同一DNA，保证准确性；操作繁琐、费时、分辨率较低、试剂毒性大。3、荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger原理，用四种不同的荧光混合物分别标记四种反应的产物，用四种反应物混合在一起进行电泳，在激光的激发下四种带有不同荧光染料标记物的ddNTP可以在同一反应管种进终止测序反应，并于变性的聚丙烯酰胺凝胶的同一泳道中进行电泳检测。当带有某种荧光素标记的DNA片段电泳到激光探头的检测范围时，激光所激发的荧光信号被探测器接受，经计算机分析数据，自动排列出DNA序列。第一代半自动测序示意图第一代全自动测序——毛细管电泳测序用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳，可使DNA的测序速度更为迅速。这种电泳装置有96个泳道，每次可同时进行96次测序，每轮实验不到2小时，1天可完成近千次反应。毛细管电泳测序装置第一代测序法的比较方法双脱氧末端终止法化学降解法荧光自动测序技术优点操作简便，结果清晰可靠，一次能确定300-500个核苷酸序列，已成为最常用的DNA测序方法不需要进行酶促反应，可以分析甲基化等DNA的修饰情况自动化程度高，高效率，精确度增加缺点花费时间过久，成本较高一次最多只能分析250个核苷酸，所用的许多化学试剂有毒纯化量小，不能纯化较长的片段第二代DNA测序技术二代测序的核心思想是边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列。第二代测序技术主要包括罗氏454公司的GSFLX测序平台、Illumina公司的SolexaGenomeAnalyzer测序平台和ABI公司的SOLiD测序平台。第二代测序技术最显著的特征是高通量,一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序,使得对一个物种的转录组测序或基因组深度测序变得方便易行。1、Roche454——GSFLX454公司可谓新一代测序技术的奠基人。2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——GenomeSequencer20System，被《Nature》杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序（sequencing-by-synthesis）的先河。后来，他们又推出了全新的GSFLX系列试剂和软件的补充，让GSFLX的通量一下子提高了5倍，准确性、读长也进一步提升。Roche454测序原理原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号的有无和强度，达到实时检测DNA序列的目的。样品处理主要是针对大片段的DNA分子，如基因组DNA、Fosmid或BAC质粒等，利用超声或氮气打断将这些DNA分子片段化，然后采用琼脂糖凝胶电泳回收或磁珠纯化，选择500-800bp的DNA片段。对于非编码RNA或PCR产物，则不需要这一步骤。一、样品处理454（GSFLX）测序技术流程二、文库制备文库制备包括接头连接和磁珠纯化两步，基因组DNA/cDNA片段经末端修复与特异性接头连接等修饰后变性处理回收单链的DNA。454的文库接头分A、B两种，各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的测序引物及4bp（TCAG）的“key”碱基构成，其中B接头的5’端带有生物素（Biotin）标记，用于磁珠纯化步骤。三、连接微珠一个DNA片段＝一个磁珠：单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上。每一个磁珠携带了一个独特的单链DNA片段。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，这样就形成了只包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。四、emRCR每个独特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。对于每一个片段而言，扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增的片