抗体库筛选技术介绍

抗体库筛选技术介绍导读自从噬菌体展示技术于1985年创立以来，细胞生物学、免疫学、蛋白质工程以及医药行业等领域深受影响。它从根本上了改变了传统的单抗制备流程（杂交瘤技间接术），宣告在体外改良抗体的特异性以及进行亲和力成熟。随着该技术的不断发展，继而出现了核糖体展示、mRNA展示、细菌展示和酵母展示等多种展示技术。这篇文章主要以噬菌体展示抗体库为例，来介绍抗体库的筛选技术。抗体库的筛选是指从抗体库中筛选出针对某一抗原的特异性抗体，是获得高亲和力抗体过程中的关键环节。那什么是抗体库呢？通过PCR和DNA重组技术克隆人类或者动物体内全套抗体可变区基因（关于抗体的具体结构详见抗体的基本结构），并通过展示技术进行表达，得到的全套抗体基因表达文库即为抗体库。图1、抗体库克隆的抗体基因片段（SCFV）图2、噬菌体展示抗体库构建流程由于单抗性质的千差万别，抗体库的筛选需要根据不同的单抗制定严格的筛选条件，优化筛选方法，因此抗体库的筛选技术一直处于发展和改进的状态，根据出现时间的先后，主要分为经典筛选法和新型筛选法。1、经典筛选法经典筛选法主要包括固相筛选法和液相筛选法，适合针对性质明确并且可纯化的抗原进行抗体筛选。固相筛选法是通过包被在酶标板或者免疫试管等固相介质上的抗原富集高亲和性的噬菌体；液相筛选法是将生物素化的抗原包被在与亲和素偶联的磁珠或琼脂糖上，通过磁珠富集能与抗原特异性结合的噬菌体抗体，再通过洗涤、洗脱、回收等步骤。如此反复筛选数次，可得到高亲和性的噬菌体。这两种方法可通过添加脱脂牛奶或者BSA来减少非特异性结合。2、新型筛选法对于抗原无法提纯或者性质不明确的情况（如癌细胞表面受体），或者经典筛选过程可能造成抗原失活的情况，需要开发新的筛选方法。目前的新型筛选法主要有细胞筛选法、组织切片或体内筛选法、选择感染筛选法和蛋白质芯片筛选法等。细胞筛选法：细胞筛选能维持抗原和抗体的天然构象，因此在对肿瘤细胞筛选方面应用较多，该技术还适合于细胞表面受体筛选和抗原鉴定等。但是细胞筛选存在一定的难度，由于细胞膜表面成分复杂，增加了非特异性的结合，筛选的轮次过多又容易丢失特异性结合的抗体。为了减少非特异性结合，细胞筛选法发展出了扣除筛选、竞争筛选和内化筛选等方法。扣除筛选是通过将抗原阴性细胞在筛选前或筛选后与抗体库结合，从而起到减少非特异性结合。内化筛选的原理是一些与细胞表面抗原结合的抗体会进入细胞内，因此可以通过细胞的内化来进行抗体筛选。具体操作是先用抗原阴性细胞对待筛抗体库进行扣除筛选，再将抗体库与抗原阳性细胞一起孵育，洗去细胞膜表面结合的抗体，裂解细胞获得细胞内的特异性结合抗体，随后进行扩增与下一轮筛选。竞争筛选是将过量阴性和阳性抗原同抗体库一起孵育，而针对阳性细胞的回收方法的不同，竞争筛选又分为荧光激活细胞分离法（fluorescently-actiscvatedcellsorting,FACS）和免疫磁性细胞分离法（immolunomagneticcellseparationmethods）。FACS法是将能待筛抗体标记上荧光素，洗涤，再通过流式细胞仪进行分选。图3、竞争筛选发流程免疫磁性细胞分离法又被称为免疫磁珠法，其原理是细胞表面抗原与连接磁珠的特异性抗体结合后能在外加磁场中停留，而不能结合的细胞则被分离出去。图4、免疫磁性细胞分离法示意图切片组织或体内筛选法切片组织和体内筛选法更接近于临床应用。切片组织筛选法是用新鲜的组织切片进行抗体筛选，但由于抗原数量有限，回收到的噬菌体抗体往往较少。体内筛选法是将待筛抗体库静脉注射进小鼠体内，数小时后取出组织或者靶器官，回收噬菌体，如此进行3~4轮，即可富集得到特异性的抗体。图5、体内筛选法示意图选择感染筛选法噬菌体展示中最常用的为PⅢ展示，即是将外源蛋白或多肽与PⅢ的N端融合，PⅢ分子含有三个结构域，氨基端结构域（NT）N1和N2，以及羧基端结构域（CT）,NT和CT之间由富含甘氨酸的连接肽（G1和G2）相连。在感染细菌时，这三个结构域和连接肽均起到重要作用。选择感染筛选法（selectivelyinfectivephage，SIP）的原理是将PⅢ的NT端用特定的多肽或者蛋白取代，当这些多肽或蛋白与带有NT端的配基发生特异性结合时，该噬菌体才具有感染的能力，因此能在细菌细胞内繁殖进而被富集。图6、选择感染筛选法示意图蛋白芯片筛选法蛋白芯片（proteinmicroarray）同基因芯片的原理类似，在载体上点布上大量不同种类的蛋白质，是一种高通量的蛋白功能分析技术。蛋白芯片筛选法能同时检测大量抗体抗原反应，通过扫描仪对荧光强度的读取，由计算机对待测样本进行分析与计算。蛋白芯片不仅具有高通量的优点，还具有高敏性和低假阳性的特点。图7、蛋白芯片筛选法示意图展望抗体库的筛选是一件费力且假阳性较高的工作，往往需要重复数轮，但是反复的筛选有可能洗脱掉一些特异性结合的噬菌体。而随着分子生物学的发展，高通量测序的应用宣告不必再进行反复筛选。实验证明，在进行一轮筛选后，对抗体库进行深度测序，即可准确鉴定阳性噬菌体。图8、高通量测序在抗体库筛选中的应用参考资料：1、汪世华.抗体技术[J].2009.2、尹长城,黄华樑,阎锡蕴.基于细胞的噬菌体抗体库筛选技术[J].中国生物工程杂志,2008,28(12):82-88.3、魏东芝,赖敏.噬菌体抗体库筛选技术[J].生命科学,2000,12(3):134-136.4、吴雯峰,王双,孙志伟.噬菌体展示抗体库筛选技术研究进展[J].生物技术通讯,2007,18(3):476-479.5、KimD,KimSR,DayDF,etal.ANovelScreeningMethodofDextranBindingAntibodyUsingPhageDisplayLibraries[C].FrontiersintheConvergenceofBioscience&InformationTechnologies.IEEE,2007:64-68.6、SassoE,PacielloR,D'AuriaF,etal.One-StepRecoveryofscFvClonesfromHigh-ThroughputSequencing-BasedScreeningofPhageDisplayLibrariesChallengedtoCellsExpressingNativeClaudin-1[J].BiomedResearchInternational,2015,2015(6):1-9.7、PaTH,JirkaSM,TenBroekeBR,etal.Phagedisplayscreeningwithoutrepetitiousselectionrounds[J].AnalyticalBiochemistry,2012,421(2):622-31.8、HoogenboomHR.Selectingandscreeningrecombinantantibodylibraries[J].NatureBiotechnology,2005,23(9):1105.