代谢组学介绍

代谢组学代谢组学技术简介技术简介代谢组学代谢组学技术简介技术简介及应用新策略及应用新策略及应用新策略及应用新策略依据研究领域分类：代谢平台代谢平台•Medicalmetabonomics（医学代谢组学）•Pharmaco-metabonomics（药物代谢组学）•Plantmetabolomics（植物代谢组学）ProfilingMetabolomics依据研究领域分类：•Microbialmetabolomics（微生物代谢学）•SubcellularMetabolomics（亚细胞代谢组学）ProfilingMetabolomics依据物质的种类分类：•维生素类•糖代谢产物脂代谢产物TargetMetabolomics•氨基酸类•脂类•木酚素•脂代谢产物•NAD代谢相关•ATP代谢相关•白藜芦醇相关•白藜芦醇相关•定义、分类•检测方法•平台选择代谢组学简介•操作流程•实验设计•实验设计•样品准备•数据分析代谢组学应用策略•NMR代谢组学实例NMR•GC-MS代谢组学实例代谢组学介绍2000metabolomicsormetabonomics4878009791244161215581000150054109174218334487050020032004200520062007200820092010201120122013120国家自然科学基金申请数量-代谢60801001200204020032004200520062007200820092010201120122013代谢组学介绍个体个体代谢组学代谢组学组织组织器官器官转录组学转录组学代谢组代谢组细胞细胞组织组织转录组转录组转录学转录学蛋白质蛋白质代谢物代谢物转录组转录组蛋白质组蛋白质组蛋白质组学蛋白质组学mRNAmRNADNADNA基因组基因组基因组学基因组学基因组基因组基因组学基因组学代谢组学介绍¾¾系统生物学：系统生物学：基因组转录组蛋白质组代谢组基因芯片基因组测序等mRNA芯片、转录组测序等mRNA芯片、转录组测序等代谢组学检测？蛋白芯片、DIGE-2D、基因组测序等转录组测序等转录组测序等？iTRAQ等代谢组学介绍为什么选择代谢组学技术？为什么选择代谢组学技术？1.1.小分子的产生和代谢是生物机体作用的最终结果，生物体液的代谢产物分析能够小分子的产生和代谢是生物机体作用的最终结果，生物体液的代谢产物分析能够更直接，更直接，更准确更准确的反映生物体的病理生理状态的反映生物体的病理生理状态更准确更准确的反映生物体的病理生理状态。的反映生物体的病理生理状态。2.2.基因和蛋白质表达的有效微小变化会在代谢物上得到基因和蛋白质表达的有效微小变化会在代谢物上得到放大放大，从而使检测更容易；，从而使检测更容易；3.3.代谢组学的代谢物信息库代谢组学的代谢物信息库简单简单，但它远没有全基因组测序及大量表达序列标签的数据库那，但它远没有全基因组测序及大量表达序列标签的数据库那么复杂；么复杂；4.4.代谢物的代谢物的种类少种类少，要远小于基因和蛋白质的数据，物质的分子结构要简单得多。，要远小于基因和蛋白质的数据，物质的分子结构要简单得多。代谢产物在各个生物体系中都是类似的所以代谢组学研究中采用的技术更容易在各个领代谢产物在各个生物体系中都是类似的所以代谢组学研究中采用的技术更容易在各个领5.5.代谢产物在各个生物体系中都是类似的，所以代谢组学研究中采用的技术更容易在各个领代谢产物在各个生物体系中都是类似的，所以代谢组学研究中采用的技术更容易在各个领域中域中通用通用，也更容易被人接受。，也更容易被人接受。1.1.定义定义2.2.特点特点1.1.定义定义代谢组学定义：代谢组学是关于生物体内源性代谢物质的整体及其变化规律的科学。代谢组学的中心任务包括检测、量化和编录生物内源性代谢物质的整体及其变化规律，联系该变化规律与所发生的生物学事件或过程的本质2.2.特点特点代谢组学的特点：作为全局系统生物学的基础和系统生物学的一个重要组成部分，代谢组学是以物理学基本原理为基础的分析化学、以数学计算与建模为基础的化学计量学和以生物化学为基础的生命科学等学科交叉的学科发生的生物学事件或过程的本质。学等学科交叉的学科。代谢组学介绍3.3.分类分类一般来说，代谢组学关注分子量1000以下的小分子化合物根据研究对象和目的的不同，科学家将代谢组学分为四个层次：个层次1）代谢物靶标分析（metabolitetargetanalysis）：某个或某几个特定组分的定性和定量分析。2）代谢指纹分析（metabolicfingerprinting）：同时对多个代谢物进行分析，不分类鉴定具体单一组分，可以对样品进行快速分类，如表型鉴定。3）代谢轮廓（谱）分析（metabolicprofiling）：限定条件下对生物体内特定组织（abiologicalcompartment）内的代谢产物的快速定性和半定量分析。4）代谢组学（metabolomics/metabonomics）：对生物体或体内某一特定组织所包含的所有代谢物进行定量分析并研究该代谢组在外界干预或疾病生理条件下动态变化规律析，并研究该代谢组在外界干预或疾病生理条件下动态变化规律。1.1.世界顶级代谢组学平台：谱图采集速率可以达到世界顶级代谢组学平台：谱图采集速率可以达到500500全扫描谱图全扫描谱图//秒（秒（500Hz500Hz）；自动峰识别和保）；自动峰识别和保真解卷积专利技术（真解卷积专利技术（TrueSignalTrueSignalDeconvolutionDeconvolution®®）；免维护离子源，对大样本量的复杂生物）；免维护离子源，对大样本量的复杂生物样本检测具有独特的优势。样本检测具有独特的优势。样本检测具有独特的优势样本检测具有独特的优势2.2.质谱数据库及保留时间指数数据库双定性，结果更可靠，更精确；质谱数据库及保留时间指数数据库双定性，结果更可靠，更精确；3.3.自主开发的单、多元变量联合统计分析方法（专利号：自主开发的单、多元变量联合统计分析方法（专利号：201310171202.8201310171202.8），数据分析更强大；），数据分析更强大；4.4.自主整合构建的质谱数据库及代谢通路数据库，适用性更强；自主整合构建的质谱数据库及代谢通路数据库，适用性更强；5.5.一站式全面解决方案，经验丰富，满足您的各种需求。一站式全面解决方案，经验丰富，满足您的各种需求。代谢组学介绍通常我们所指的代谢组学，是指通过比较对照组和实验组的代谢组（metabolomes，某一生物的所有代谢物组分），以寻找其代谢谱差异的研究方法。VSAgilent公司将其称为：发现代谢组学靶标代谢组学代谢组学检测方法GC-MSLCMSGCMSLC-MS代谢组学metabonomicsNMRNMR代谢组学检测方法GC-MSGC-MS，GC×GC-TOF-MS，GC×GC—Quadropole-MS质谱联系统台Agilent7890A\5975C®质谱联用系统3台LecoPegasus4DGC×GC-TOF-MS系统2台LC-MSLC-MS，LC×LC-MS，LC-CE-MS，LC-NMR-MS，HPLC-TOF/MS，HPLC-ESI/MS/MS，UPLC-TOF/MSWatersACQUITYUPLC+MicromassQ-TOFWatersACQUITYUPLCMicromassQTOFPremierMS质谱联用系统1台NMR氢谱（1HNMR）、碳谱（13CNMR）及磷谱（31PNMR）。HR-MASNMR（高分辨魔角旋转核磁共振），HPLC-DAD-MS-SPE-NMRViI600MH®NMR系统1台VarianInova600MHz®NMR系统1台Bruker600MHz®NMR系统1台不同技术平台优缺点NMR优点：无损伤性，无辐射性，无偏向性，方法灵活，处理简单，成本低缺点灵敏度较低动态范围有限缺点：灵敏度较低，动态范围有限GC-MS优点：较好的分离效率和检测灵敏度，易定性缺点：衍生化限制了应用范围，具有偏向性LC-MS优点：灵敏度较高，无需衍生化缺点：分离率不高，具有偏向性，不易定性不同技术平台优缺点糖类物质衍生化以后用GC-MS检测化合物分类及其最适的分析技术☻☻代谢组学操作流程代谢组学实验设计微生物和植物每组6个以上越多越好每组6个以上，越多越好模式动物模式动物每组10个左右，越多越好临床标本每组30个左右，越多越好代谢组学样品处理微生物和细胞样本迅速钝化代谢活动（淬灭）如研究胞外代谢需保持细胞不裂解样本采集与预处理¾微生物和细胞样本：迅速钝化代谢活动（淬灭），如研究胞外代谢，需保持细胞不裂解¾动物体液（如尿、血、组织、器官、唾液）：采样后要迅速预处理，如加入抗凝血剂、防腐剂，并立即冷冻处理（‐80 ℃）¾植物样本：采集后迅速冷冻（液氮），然后转入‐80 ℃保存血清样品制备¾500ul/例（不得低于200ul/例），一定避免反复冻融。¾血液收集在离心管中静置30分钟进行凝固。然后离心取上清装载干净的离心管中，再离心5分钟，8000rpm，取上清分装到冻存管中，每管0.5ml，-80度冻存寄送。¾注意：1）取血时如用酒精消毒，请擦干擦拭部位，待酒精完全挥发后再取样。取血时如用麻醉剂建用异氟醚防在血清谱图中出扰峰2）取血时如用麻醉剂，建议用异氟醚，防止在NMR血清谱图中出现干扰峰。3）如要采用血浆，请务必使用肝素钠抗凝管。尿液样品制备¾1ml/例，原则上可以多取一点。¾尿液直接分装到离心管中，每管1ml，添加一滴（约10ul）质量体积为1/100（w/v）的叠氮化钠80度冻存寄送叠氮化钠，-80度冻存寄送。代谢组学数据分析-数据预处理NMR谱图LC-MS总离子流色谱图GC-MS总离子流色谱图GC×GC-MS图谱代谢组学数据分析-PCA分析ScoresplotofPCA(2D)ScoresplotofPCA(3D)代谢组学数据分析-PLS-DA分析ScoresplotofPLS-DA(2D)PermutationtestofPLS-DA代谢组学数据分析-OPLS-DA分析LoadingplotofOPLS-DAScoresplotofOPLS-DA（2D）LoadingplotofOPLS-DA代谢组学数据分析-差异物质筛选VarID(Primary)PEAKRTCOUNTMASSVIPP-VALUEFOLDCHANGEGCGC--MSMS差异化合物筛选：差异化合物筛选：1norvaline4.63168161441.254490.001559511.7370974542glycocyamine14.6415211840.1312740.794479571.25365303230beta-Alanine25.62654181141.134190.00721941.159951339……………………保留时间(min)质荷比p-value(T-test)均值对数比(B/A)中值对数比(B/A)0672030522369E-1016161751LCLC--MSMS差异化合物筛选：差异化合物筛选：0.67203.05223.69E101.6161.7514.24447.09230.0026771.3451.9343.26431.09730.0003851.2722.0190.72132.07611.55E-051.1071.2040.58110.00898.9E-060.7151.066MetabolitesraA-BA-CB-CR2X215%R2X189%R2X185%……….……NMRNMR差异化合物筛选：差异化合物筛选：R2X=21.5%;R2Y=0.914;Q2=0.229R2X=18.9%;R2Y=0.901;Q2=-0.159R2X=18.5%;R2Y=0.930;Q2=0.309Acetate:1.92(s)-0.6230.5950.814Alanine:1.48(d)-0.584--0.619…………代谢组学数据分析-层次