移液和移液器的一些基础知识

移液和移液器的一些基础知识林泗聪Oct2010讨论议程移液器的原理和分类移液技术简介移液操作的注意事项特殊样品的移液技巧移液器的维护与保养移液器的校准2移液器的原理•移液器根据使用原理分为两种，一种是空气置换式（或气体活塞式，Airdisplacement），另一种是正压式（或外置活塞式，是正压式（或外置活塞式，PositiveDisplacement）空气置换式适常规移液操作空气置换式•空气置换式适于常规移液操作（液体跟活塞间充满空气）空气置换式•正压式适于操作高粘度液体（活塞和液体直接接触）正压式3移液器的分类4移液技术•正向移液¾量程设定，将移液器排放按钮按至第一停点¾平稳松开按钮，液体吸入吸头内¾放液时吸头紧贴容器壁先将排放按钮按至¾放液时，吸头紧贴容器壁，先将排放按钮按至第一停点，略作停顿以后，再按至第二停点5移液技术•反向移液¾将按钮压至第二停靠点¾将吸头浸入液面，使控制钮缓慢滑回原位松开按钮吸样¾放液时吸头紧贴容器壁先将排放按钮按至第停点¾放液时，吸头紧贴容器壁，先将排放按钮按至第一停点¾剩余体积废弃或还回原容器¾释放时至第一停点即可，松开按钮6移液技术•反复移液¾将按钮压至第二停靠点¾将吸头浸入液面，使控制钮缓慢滑回原位松开按钮吸样¾放液时吸头紧贴容器壁先将排放按钮按至第停点¾放液时，吸头紧贴容器壁，先将排放按钮按至第一停点¾重复如图第三、四步骤¾剩余体积废弃或还回原容器¾释放时至第一停点即可，松开按钮7移液技术•全血移液法¾将按钮压至第一停点¾将吸头浸入液面，使控制钮缓慢滑回原位松开按钮吸样¾吸头紧贴容器壁，先将排放按钮按至第一停点，然后放液，重复如图第三、四步骤3-4次，直至液体放干净为止¾最后按下按钮至第二停点把吸头内壁的液体彻底排尽最后按下按第停点把吸头内的液体彻底排尽¾松开按钮8移液操作的注意事项–吸头选择合适的吸头对于最终移液的准确性影响很大，一般可以遵守如下原则：很大，般可以遵守如下原则：¾最好选择移液器初始校准时使用的吸头，商即厂商推荐的吸头；¾装吸头步骤：在移液器的套柄最下端进入¾装吸头步骤：在移液器的套柄最下端进入吸头后，对于盒装吸头，在轻轻向下压的同时左右晃动移液器1－2秒即可；如果是散装吸头在用手把吸头往移液器方向轻轻施压吸头，在用手把吸头往移液器方向轻轻施压的同时稍稍转动吸头1－2秒即可。9移液操作的注意事项–量程¾一般说来，移液器的可用量程范围是移液器最大量程的10-100％在称呼移液器时一般使用的是其最大的10-100％。在称呼移液器时，般使用的是其最大液程；¾对特定的一支移液器，其移液的精度随移液量的降低而降低。一般最佳的量程范围是移液器最大量程的30-100％；30100％；¾在调节量程的过程中，遵守“从大到小”的原则。具体来说当把大量程调为小量程（如从200调到100）来说，当把大量程调为小量程（如从200ul调到100ul）时，直接调节到位即可；当把小量程调为大量程时，需先超过所需量程1/3到1/2圈，然后再回调到所需的量程。这样做是为了消除移液器本身的机械误差。10移液操作的注意事项–吸液¾洗液前润洗：在正式移液前，先用吸头吸取待转移的液体，然后再把它作为废液排掉。润洗转移的液体，然后再把它作为废液排掉。润洗吸头的目的是减少吸头内壁吸附力对精度的影响，润洗次数以2次为宜；¾吸液角度：在移液的过程中须一直保持移液器在竖直状态，最大倾角不超过20°（一般有倾角会导致实际吸液量偏大）；¾吸液深度般100l左右的移液需要浸入2¾吸液深度：一般100ul左右的移液需要浸入2-3mm即可，上下可以有1-3mm的浮动（过分浸入会导致外壁残留液体增多，特别是微量移液液）；11移液操作的注意事项–吸液¾吸液速度：在吸液过程中，须慢慢降低拇指的下压力使液体在吸头内均匀且缓慢的指的下压力，使液体在吸头内均匀且缓慢的上升；¾停留时间：对于大量程移液（ml级）和粘度较高样品的移液，在吸液时松开拇指后，须使吸头在液体内停留3－5秒后才能移出须使吸头在液体内停留35秒后才能移出12移液操作的注意事项–排液排液的方式主要有三种：¾（1）吸头贴容器的内壁排液，这是最常用和最经典的排液方式；）直接在液体上方排液这种方法简单而不容易受客观因素限制¾（2）直接在液体上方排液，这种方法简单而不容易受客观因素限制；¾（3）将吸头插入液面下排液，这主要用于小量程移液器或特殊液体的排液，只是注意一定要在吸头从液体中移出后放开松开拇指。只是注意定要在吸头从液体中移出后放开松开拇指。13特殊样品的移液技巧¾易挥发液体：在移液前需要润洗2-3次，在吸液完成后尽快排液尽量减少液体在吸液完成后尽快排液，尽量减少液体挥发的损失；为避免损坏活塞，推荐使用带滤芯吸头；Thermo旗下MBP低阻滞吸头产品¾高粘度样品：采用反向移液的模式进行移液，同时在吸液和排液时均需要3-行移液，同时在吸液和排液时均需要35秒的停留时间；¾精细微量的样品：采用反向移液的模式进行移液；为减少样本损失，推荐使用低吸附吸头14特殊样品的移液技巧¾高密度/低密度样品：移液器的精度数值都是基于转移纯水在移液前需要先明都是基于转移纯水，在移液前需要先明确样品的密度，然后把量程调节成待转移体积与密度的乘积；¾高温/低温样品：在移液前绝不可润洗吸头，为避免温度的影响，每次移液均需头，为避免温度的影响，每次移液均需更换吸头，在吸液完成后尽快排液¾高传染样品采用带滤芯吸头避免用¾高传染样品：采用带滤芯吸头，避免用于移液器管咀被污染，而导致移液过程中的交叉污染左为：Thermo旗下MBP的ART®自封闭防回渗吸头；右为普通吸头15给您的移液器找个家移液器不使用时，竖直放置在枪架上16移液器维护和保养•常规维护，漏液排查常规维护，漏液排查•用70%的酒精或异丙醇擦拭表面•定期校验，六月一次定期校验，六月次17移液器维护和保养•漏液排查漏液排查•吸液后，垂直放15秒，观察吸头内月牙形液面是否下降。如果液面下降首先检查吸头头是否有问题，如有问题更换吸头。更换吸头后液面仍下降说明活塞组件有问题，应找专业维修人员修理业维修人员修理。18特殊样品的维护办法液体举例移液器选择吸头移液技术除垢方法备注水溶液和缓冲液缓冲液或稀释的盐溶液气压式标准吸头正向移液打开移液器，用蒸馏水冲洗污染部分粘稠性样品蛋白质、核酸、甘油、吐温20/40/60/80气压式外置活塞式标准、外置活塞式吸头反向移液缓慢操作避免气泡产生外置活塞式快速移液避免挥发带活易挥发样品乙醇、正己烷外置活塞式气压式外置活塞式、带滤芯吸头正向移液快速移液避免挥发。带活性碳滤芯的吸头核酸溶液基因组DNA，PCR产物气压式外置活塞式带滤芯吸头和外置活塞式吸头正向移液在氨基乙酸／盐酸缓冲液（ＰＨ２）中煮沸１０分钟，用蒸馏水洗净广口吸头可以避免机械剪切力对核酸的损坏气压式外置活塞带滤芯吸头和外置活塞式放射性物质C14气压式、外置活塞式带滤芯吸头和外置活塞式吸头正向移液无机酸硫酸、盐酸气压式带滤芯吸头正向移液用蒸馏水清洗移液器下部塑料材质活塞是耐酸材料，除氢氟酸以外，具体参照化学适配性表碱性溶液氢氧化钠气压式带滤芯吸头正向移液用蒸馏水清洗移液器下部塑料材质活塞是耐碱材料，具体参照化学适配性表有潜质传染性液体外置活塞式外置活塞式、带滤芯吸头高温高压整支灭菌，或消毒剂浸泡19为何校准概念概念校准校准比较测量值和设定值之间的差异，评估实际测量结果偏调整调整移液器螺母，使调整后的校准结估实际测量结果偏差是否在允许值范围内。果在设定量程允许值范围内。20影响移液的因素液体性质液体性质密度、蒸气压、蒸发度、粘度、表面张力温度、压力环境因素环境因素温度压力湿度、通风操作者操作者移液深度、角度、操作致性操作者操作者操作一致性21影响移液的因素几个影响移液精准性因素的小问题：1)转移100μl苯（密度为0.7138g/ml），实际移液体积偏少还是偏多？2)100ul的移液器，用10μl吸头和100μl转移10μl纯水，哪个偏大？2)100ul的移液器，用10μl吸头和100μl转移10μl纯水，哪个偏大？3)用下部细长的上样吸头吸10μl纯水，实际移液体积如何？4)30度倾斜吸液时，实际移液体积偏大还是偏小？5)样品从冰箱里拿出来移液，实际移液体积偏大还是偏小？6)移液器从冰箱里拿出来实际移液体积偏大还是偏小？6)移液器从冰箱里拿出来，实际移液体积偏大还是偏小？7)吸头从冰箱里拿出来移液，情况又是如何？22影响移液的因素–一个公式••DV=DV=VaVa--VlVl∝∝V0*V0*ρρ*g*h/P0*g*h/P09DV活塞置换的空气体积与吸头进入液体的体积之差9DV：活塞置换的空气体积与吸头进入液体的体积之差9Va：活塞置换的空气体积9Vl：吸头进入液体的体积9V0：吸头和移液器内的空气体积9ρ液体的密度9ρ：液体的密度9g：重力常数9h：吸头进入液体的高度9P0：大气压•由该公式可见，DV或Dl的数值与多个参数有关：¾V0值：不同的吸头V0值也不同，因此理论上更换吸头需要重新校准；¾ρ值：一般出厂校准是纯水，因此待转移液体的密度也会影响使用；值该值与吸头前端的形状移液角度有关¾h值：该值与吸头前端的形状、移液角度有关¾P0值：蒸汽压、蒸发度、湿度、通风、海拔高度都均会影响P0值23影响移液的因素–另一个公式••DV=DV=VaVa--VlVl==(1(1--Tp/Tp/TtTt)V)V9DV活塞置换的空气体积与吸头进入液体的体积之差9DV：活塞置换的空气体积与吸头进入液体的体积之差9Va：活塞置换的空气体积9Vl：吸头进入液体的体积9Tp：移液器内封闭气体的温度9Tt吸头内封闭液体的问题9Tt：吸头内封闭液体的问题9V：设置的吸取液体的液程•该公式反映温度（包括移液器内和吸头内的温度）以及设置液程对DV或Dl数值的影响：¾移液器的温度偏低，实际量取液体体积偏低；¾吸头的温度偏低实际量取的液体体积偏高¾吸头的温度偏低，实际量取的液体体积偏高；¾可以通过更改设置的液程来纠正温度的影响24为何校准因此我们至少有如下的理由：•出厂时的校准以三级水作为校准样品校准•出厂时的校准吸头是专门的适配性吸头常规实验并不是经常移取纯水或性质类似的溶•常规实验并不是经常移取纯水或性质类似的溶液•客户端的实验环境不同于工厂的校准条件客户端的实验环境不同于厂的校准条件•实际测定时缺乏环境相关影响的Z因子•在移取特定样品时，如移取高粘稠性、高密度溶液温度变化大样品时为确保移液准确请溶液、温度变化大样品时，为确保移液准确请重新调整移液器•在高压消毒或其他拆卸后，移液器需要重新校在高压消毒或其他拆卸后，移液器需要重新校准•……25如何校准校准的时间校准的地点校准的环境校准的校准的校准的校准的校准的环境校准的操作人员校准的校准的有效性有效性校准的校准的有效性有效性校准的标准溶液26在线校准测试液体水蒸馏水或去离子水达到ISO3696三级水的检测液体和环境要求•测试液体：水、蒸馏水或去离子水，达到ISO3696三级水的标准。测试液体的温度和室温一致•实验室条件：•测试应该在无通风的房间•相对湿度必须在50%以上•湿度会影响液体的蒸发和静电形成•空气温度在1530℃之间温差±05℃•空气温度在15-30℃之间，温差±0.5℃•检测时：移液器和测试液体在检测温度下放足够长的时间确保检测时：移液器和测试液体在检测温度下放足够长的时间确保平衡27在线校准软件28在线校准软件29在线校准软件在以下界面输入基本参数：温度、大气压力蒸发损失移液器的量大气压力、蒸发损失、移液器的量程、序列号、多道移液器输入多通道数量30在线校准软件31如有其它市场、产品、技术、推广问题及反馈请与我联系：林泗聪移液器销售工程师实验室耗材部林泗聪移液器销售程师实验室耗材部[e-mail]1868841225032