DNA测序分析常见问题整理

AppliedBiosystems3730/3730xlDNAAnalyzersDNA测序分析常见问题整理测序结果—峰图四色图谱：每一种颜色对应一种碱基ATCG•引物•DNA模板•纯化•困难模板•机器影响影响测序质量的主要因素一、引物对测序结果的影响①引物合成时多（少）一个碱基②引物不纯③模板上没有引物结合位点④引物二聚体⑤双引物结合合成时部分引物多一个碱基合成时部分引物少一个碱基●现象：每个峰后面有个同样荧光信号的小“尾巴”。●原因：合成时引物多一个碱基。●对策：重新合成引物●现象：每个峰前面有个同样荧光信号的小“尾巴”。●原因：合成时引物多一个碱基。●对策：重新合成引物引物（模板）不纯●现象：整个峰图噪音都比较高。（区别与小片段的干扰）●原因：引物（模板）纯度太低，含有较多杂质●对策：–建议使用HPLC（柱子纯化）或PAGE纯化的测序引物。–脱盐纯化的引物纯度较低，适合做普通PCR，但不建议用来测序。模板上没有引物结合位点●现象：没有特异性的测序峰图●原因：引物无法结合模板●对策重新设计引物引物二聚体●现象：前面100多bp噪音高，后面正常（引物二聚体片段小大在100bp左右）●原因：引物二聚体未去除干净●对策：割胶纯化双引物结合●现象：从一开始（区别于非单克隆）就出现两套峰●原因：模板有两个引物结合位点，同时和两个引物结合●对策：重新设计单个引物二、模板对测序结果的影响①模板不纯②点突变（SNP）③移码突变④杂合子⑤非单克隆噪音信号高终止峰PCR正常终止后面的噪音峰PCR正常终止正常模板与噪音模板不纯（非特异性PCR产物）●现象：每个峰下面都有其它颜色●原因：PCR主带与杂带混在一起测序●对策：凝胶电泳回收主带，重新测序割胶纯化点突变（SNP）突变点如果模板有单核苷酸（碱基）突变（SNP），测序图形中其他的位点一般都是单一的峰形，然后突然在某一个位点出现重叠峰(如图中箭头所示)。移码突变在450bp处因点突变导致移码，在528bp处又因点突变恢复杂合子杂合变点杂合信号处的套峰强度大小相等，都相当于正常峰值的一半。非单克隆特征：左边清晰，右边全部像杂合子原因：挑克隆时两个质粒混在一起对策：新挑克隆，重新制DNA三、纯化对测序结果的影响①染料峰②酒精峰③荧光物质污染④钉子峰⑤有机物污染（瀑布效应）染料峰特征：染料峰位于序列的前100bp左右，是残余的A、T、C、G、4个BigDye峰，其不影响其它序列的可靠性。酒精峰特征：酒精峰位于序列的200bp-300bp碱基之间，图谱被“透明”抬高，其同样不影响其它序列的可靠性。荧光物质污染●现象：红色峰异常高。●原因：未知大分子荧光物质污染，恰好是红色，被软件误认为红色峰。●对策：依次更换水、缓冲液、甲酰胺、测序胶、毛细管；清洗或更换胶引导块、针筒。“钉子”峰●现象：四色并存突然拔起的尖峰，峰形锐利。●原因：毛细管内有气泡、灰尘、尿素结晶等，对激光全反射。●对策–灌胶时，避免气泡产生；–上样前，样品先离心；–毛细管、检测窗口保持清洁；–胶内有尿素结晶时，注意不要吸进注射器；–样品纯化干净。有机物污染（瀑布效应）●现象：基线从高处突然下降。●原因：有机物进入毛细管，受激发产生一定波长的荧光，抬高基线。●对策：依次更换水、缓冲液、甲酰胺、测序胶、毛细管；清洗或更换胶引导块、针筒。四、困难模板对测序结果的影响①特殊结构②Ploy结构③高GC④重复序列⑤回文结构特殊结构Poly结构Poly在序列的前端对信号影响较小,Poly在序列的后端对信号影响较大。Poly-G/poly-C很容易导致信号中断和信号乱。高GCPoly-G/poly-C是高GC的一种，很容易导致信号衰减。局部高GC一般会导致信号中断和乱峰。重复序列GT重复导致信号衰减A/G重复导致信号衰减或信号乱回文结构其他复杂的二级结构也会导致衰减四、机器因素对测序结果的影响①毛细管寿命②其它毛细管寿命突起部分峰的左右不对称，向后拖，有小突起