病毒学研究方法简介

病毒学研究方法简介生物安全实验室•P1实验室——研究的病毒危险性较低，试验人员连口罩都不用带，穿上白大褂就可以了，试验人员在这里很放松；•P2实验室——研究的是中度危险的病原，像肝炎、流行性感冒等等，要求戴防护性较好的口罩；•P3实验室——研究的是高度危险的病毒，传染性很强，而且没有疫苗，试验人员的保护措施要比P1/P2实验室严密得多；•P4实验室——全球级别最高的生物安全实验室，研究的是极度危险的病毒，如令人谈之色变的埃博拉病毒、马尔堡病毒，进入这种实验室的工作人员，处于防护服的严密保护之下，连空气都不能在实验室内呼吸，红色螺旋状管子，是专门用来向室内输送新鲜空气的，试验人员一进入实验室，要先屏住呼吸，马上接上这种管子，然后才能呼吸。根据微生物及其毒素的危害程度不同，分为４级，一级最低，四级最高。病毒学研究的主要方法•生物学特性测定:在宿主上的反应——症状、传播等•病毒分离与培养：提纯与纯化、二元培养法•光镜与电镜观察：病毒粒子和病毒与相应抗血清的特异免疫吸附情况•免疫学技术：以血清学和组织免疫化学方法检测带毒情况、多克隆抗体、单克隆抗体•分子生物学技术：核酸分子杂交、PCR等一、生物学特性测定•在宿主上的反应宿主范围、症状表现、传播方式等•病毒的理化性质病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性、体外存活期等•病毒接种方法注射接种、病毒组织培养技术植物病毒——汁液摩擦接种、昆虫介体接种、嫁接接种、菟丝子接种法等巨细胞病毒感染细胞的典型“猫头鹰眼”样核内包涵体冠状病毒感染——“非典”X线胸部检查可见肺部不同程度的片状阴影，少数病人进展迅速，呈大片状阴影，大多数为双侧改变，阴影吸收消散较慢。TMVtransmissionbyanApissp.Aseveremosaicsymptomontomatoleaf(TMV)腿色斑Chloroticspoting黄化Yellowing病毒检测二、病毒的分离与鉴定提纯extraction/纯化purification病毒的分离与鉴定动物接种组织培养标本采集标本处理后接种鸡胚接种卵黄囊膜尿囊液羊膜腔液绒毛尿囊膜观察囊膜病变血凝试验血凝抑制试验CPEEM包涵体空斑试验红细胞吸附中和试验观察发病抗原检测抗体检测病理检查病毒的提纯是将宿主中的病毒粒子与宿主细胞组分区分开来的过程。原理是利用病毒的蛋白质和大分子粒体的特性，及其与宿主细胞组分在理化特性上的差异将病毒粒子区分出来，并尽可能保持侵染力。目的是确切地研究病毒理化、生物学特性、化学组分、组成、增殖过程及机制，还可用于制备高效价的抗血清。•1953年，斯坦利第一次提取并结晶了TMV，这是病毒学史上一个重要的里程碑。（一）病毒的纯化与提纯一般纯化方法•动物病毒的纯化：从空斑、病斑分离，用终点稀释法•植物病毒的纯化：如确定是一种病毒，且可机械摩擦接种，则接种到适当寄主上；如可能有多种病毒，则要嫁接传染，先将病毒保存，然后试用虫媒或其他方法分离。二、病毒的分离与培养1、差速离心和密度梯度离心•差速离心：交替使用高速和低速离心高速离心（40000~80000g）使病毒沉淀，取沉淀低速离心（约4000g）仅去除大的细胞碎片等杂质，取上清•密度梯度离心：部分或完全根据颗粒在一个无对流介质中的密度而获得分离蔗糖10%~40%CsCl等（三）病毒提纯的技术二、病毒的分离与培养2、沉淀法简便快速但粗糙易变性盐析法硫酸铵浓度达30~50%饱和度时多数病毒沉淀等电点沉淀加醋酸或盐酸丙酮沉淀浓度达40~70%聚乙二醇沉淀浓度达4~8%乙醇沉淀浓度达20%沉淀植物蛋白，上清夜用硫酸铵沉淀3、吸附法磷酸钙、离子交换树脂、羧甲基纤维素4、酶处理许多病毒抗蛋白酶和核酸酶（三）病毒提纯的技术二、病毒的分离与培养5、有机溶剂萃取有机溶剂可溶掉脂肪、有色杂质或非病毒的变性蛋白，如脊髓灰质炎病毒提纯中用正丁醇：要考虑病毒对有机溶剂的耐受性（三）病毒提纯的技术脂肪变性非病毒蛋白病毒水醇二、病毒的分离与培养6、电泳法普通电泳、密度梯度电泳、等电聚焦电泳等7、柱层析法吸附：用离子交换或吸附法分子筛：琼脂糖或葡聚糖制成凝胶柱8、抗血清处理针对宿主蛋白的血清来沉淀杂蛋白加病毒的抗血清形成病毒—抗体复合物（三）病毒提纯的技术二、病毒的分离与培养要证明某种疾病是某一感染因子所引起．则必须满足Rivers法则：①从患病者体内分离出病毒；②在实验动物或寄主细胞中可以培养；③证明这种培养物具有滤过性；④在原始宿主或相关种内能产生同样的病症；⑤能重新分离出病毒。•病毒的分离与鉴定组成了病毒学诊断技术的主体。•病毒分离(virusisolation)是诊断病毒感染的“金标准”(goldstandard)。二、病毒的分离病毒的分离•组织培养•鸡胚培养•动物接种组织培养：原代细胞：新鲜组织+胰蛋白酶消化，分散+培养液成——单层细胞二倍体细胞株：原代细胞传代（为二倍体细胞）传代细胞系：肿瘤组织或二倍体细胞自发转化（非整倍体）二、病毒的分离与培养卵黄囊接种：用5~8d鸡胚，以细长针由气室端刺入卵黄囊，孵育后收集卵黄囊膜检查。常用于一些嗜神经病毒羊膜腔：用12~14d鸡胚，将检材注入羊膜腔，孵育后取羊水检查。常用于流感病毒的初次分离尿囊腔：用9~12d鸡胚，将标本接种于尿囊腔，孵育后取尿囊液检查。常用于培养流感病毒和腮腺炎病毒等绒毛尿囊膜：用10~12d鸡胚，无菌下开一小窗，将材料滴在绒毛尿囊膜上，孵育后观察膜上有无斑点病变。常用于培养单纯疱疹病毒，天花病毒和痘病毒鸡胚接种绒毛尿囊膜痘病毒特异性损伤3.动物接种•常用动物小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。不同病毒对动物的敏感性不同，根据病毒种类加以选择。•接种途径按病毒侵袭部位选择相应的接种途径：–乙型脑炎病毒及狂犬病毒小鼠脑内接种–柯萨奇病毒乳鼠腹腔接种–乙肝病毒黑猩猩静脉注射–流感病毒鼻腔滴种•用途分离鉴定病毒，制备疫苗，制备抗血清标本制备浓缩标本有以下几种方法：①超速离心离心的时间和速度取决于病毒颗粒的大小和离心机转头的半径，一般是30min到3h．沉淀的样本用灭菌蒸馏水洗后再放到铜网上；②超过滤法用于分子筛的蛋白质相对分子质量为10000；③接种细胞接种细胞增殖病毒，然后快速包埋、切片；④免疫凝集如有特异抗血清，且病毒已知，也可用该法浓缩病毒三、病毒的光镜与电镜观察法光镜：宿主组织切片、包涵体三、病毒的电镜观察法1、正染法（超薄切片法、病组织）–将细胞用戊二醛固定，然后脱水、包埋、切片、染色、观察病毒颗粒，通常1~2d完成。–操作复杂、费时，但样品可长期保存，可观察病毒粒子形态与发生过程。2、负染法–直接将病毒悬液(也可用细胞)滴在铜网上，用重金属(通常用磷钨酸)进行染色，观察病毒颗粒，10-20min可出结果。–原理：负性染料不渗入病毒颗粒，而是将病毒颗粒包绕，由于负性染料含重金属使电子束不能穿透，病毒颗粒具有亮度，在周围暗背景上显示亮区——较正染法显示的图像清晰，可显示病毒的结构。–缺点：敏感性低，要求病毒量在107／mL以上，同科病毒难于鉴别。3、投影技术4、胶体金标记技术、与免疫学技术结合等采用几种电镜技术观察病毒粒子的形态Orfvirus：口疮病毒(接触性脓疱皮炎)Ebolavirus埃博拉病毒（正染技术）Vacciniavirus痘苗病毒（投影技术）负染技术美国疾病控制和预防中心公布的一张未标明日期的彩色电子显微照片。它显示出H5N1型禽流感病毒（金黄色）在MDCK细胞（绿色）培养液中的活动状态电镜技术的应用•研究病毒形态、鉴定观察病毒的形态及形态发生学过程；亚显微结构；病毒与宿主细胞的关系；病毒感染细胞的超微结构改变；病毒的分类等。•诊断病毒病检测不能在体外培养的病毒，如轮状病毒、星状病毒、嵌杯病毒、HAV等都是用电镜最先发现的——能进一步发现新的病毒和病毒病。四、免疫学技术1、病毒抗原2、病毒抗体3、免疫学诊断方法免疫荧光法(IF)免疫酶法（ELISA）单克隆抗体技术血凝抑制（HI）试验血凝试验HA琼脂扩散试验五、病毒抗原检查•可检测细胞内、外的游离病毒抗原。•敏感、特异，简便、快速。适用于多种病毒性疾病的早期快速诊断。InfluenzavirusA培养物DFA染色阳性生殖道HSV-2涂片DFA染色阳性五、分子生物学技术•聚合酶链反应（PCR）•核酸分子杂交：Southernblot、Nouthernblot和Westhernblot•蛋白质组学•基因组学：核酸序列测定及基因功能•基因工程：抗病毒疫苗或抗病毒的大分子多肽、病毒载体