紫外-可见分光光度法

1第七章吸光光度法7.1概述7.1.1分类吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特点而建立起来的分析方法，它包括比色分析法、可见及紫外吸收光度法以及红外光谱法等。本章着重讨论可见光区的吸光光度法（又称分光光度法，简称光度法）。定义：基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法称为吸光光度法，包括比色法，可见分光光度法及紫外分光光度法等。比色分析法：许多物质是有颜色的，例如高锰酸钾在水溶液中呈深紫色，Cu2+在水溶液中呈蓝色。这些有色溶液颜色的深浅与这些物质的浓度有关。溶液愈浓，颜色愈深。因此，可以用比较颜色的深浅来测定物质的浓度，这种测定方法就称为比色分析法。目前已普遍地使用分光光度计进行比色分析。应用分光光度计的分析方法称为分光光度法。这种方法具有灵敏、准确、快速及选择性好等特点。吸光光度法试液的浓度下限：10-5----10-6mol/L。吸光光度法测定的相对误差：2%—5%，可以满足微量组分测定对准确度的要求。7.1．2特点分光光度法同化学分析法中的滴定分析法、重量分析法相比，有以下特点：1.灵敏度高分光光度法测物质的浓度下限（最低浓度）一般可达10-5~10-6mol/L，相当于含量低于0.001~0.0001%的微量组分。如果将被测组分加以富集，灵敏度还可提高1~2个数量级。该方法适用于微量组分的测定。2.准确度较高一般分光光度法的相对误差为2~5%。3.操作简便，测定速度快分光光度法的仪器设备不复杂，操作也简便。如果采用灵敏度高，选择性好的显色剂，再采用掩蔽剂消除干扰，可以不经分离直接测定，而且速度快。27.2基本原理7.2.1光的基本特性物质呈现的颜色与光有着密切的关系。光是一种电磁波，如果按照波长或频率排列，则可得电磁波谱图（四师P.275表10-1）。光具有两象性：波动性和粒子性。波动性就是指光按波动形式传播。例如：光的折射、衍射、偏振和干涉现象，就明显地表现其波动性。λ·ν=c式中：λ—波长（cm）；ν—频率（赫兹）；c—光速（≈3×1010cm/s）光的粒子性：如光电效应就明显地表现其粒子性。光是由“光微粒子”（光量子或光子）所组成。光量子的能量与波长的关系为：E=hν=hc/λ式中：E—光量子的能量（尔格）；ν—频率（赫兹）；h—普朗克常数（6.6262×10-34J·秒）.光色的互补关系首先要明确什么叫单色光、复合光、可见光。理论上将具有单一波长的光称为单色光；由不同波长的光组合而成的光称为复合光；人眼能感觉到的光称为可见光（其波长范围大约在400~750nm之间）。日光、白炽灯光等可见光都是复合光。如果让一束白光（日光）通过棱镜，于是发生折射作用，便分解为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等颜色的光。（各色光之间没有明显的界限）。各种色光的近似波长（见课件）。反之，这些颜色的光按一定强度比例混合便能形成白光。如果把两种适当颜色的单色光按一定强度比例混合后，就能得到白光。我们便称这两种单色光为互补色光。3日光、白炽灯光等就是一对对互补色光按一定适当比例组合而成的。互补色光的关系可用右图表示。7．2.2.物质对光的选择吸收对固体物质来说，当白光照射到物质上时，如果物质对各种波长的光完全吸收，则呈现黑色；如果完全反射，则呈现白色；如果对各种波长的光均匀吸收，则呈现灰色；如果选择地吸收某些波长的光，则呈现反射或透射光的颜色。对溶液来说，溶液呈现不同的颜色是由于溶液中的质点（离子或分子）对不同波长的光具有选择性吸收而引起的。当白光通过某种溶液时，如果它选择性地吸收了白光中某种色光，则溶液呈现透射光的颜色，也就是说，溶液呈现的是它吸收光的互补色光的颜色。例如：当一束白光通过硫氰酸铁（Fe(SCN)3）溶液时，它选择性地吸收了白光中的蓝青色光，其它色光均透过溶液。铜铵络离子的溶液因选择地吸收了白光中的黄色光而呈现蓝色。溶液呈现不同颜色乃是由于物质对光的选择吸收所造成的。当一束白光（强度为I0）通过下列几种溶液，溶液呈现的颜色和吸收光的关系如下图：4如果将各种波长的单色光依次通过某一固定浓度的有色溶液，测定每一波长下有色溶液对光的吸收程度（即吸光度A），然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得一曲线，称为吸收光谱曲线（简称吸收曲线）。是四个不同浓度KMnO4溶液的光吸收曲线。从图上可以看到：⑴KMnO4溶液对不同波长的光吸收程度不同。⑵不同浓度KMnO4溶液的吸收曲线形状相似，最大吸收波长不变。⑶同一物质不同浓度的溶液，在一定波长处吸光度随浓度增加而增大（这个特性可作为物质定量分析的依据）。若在最大吸收波长处测定吸光度，灵敏度最高。57.2.3光吸收的基本定律—朗伯-比尔定律1、示意图图朗伯-比尔定律示意图当一束平行单色光照射到任何均匀、非散射的介质（固体、液体或气体），例如溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液，一部分被器皿的表面反射。如果入射光的强度为I0，吸收光的强度为Ia，透过光的强度为It，反射光的强度为Ir，则I0=Ia+It+Ir（1）在吸光光度法中，测量时都是采用同样质料的比色皿，反射光的强度基本上是不变的，其影响可以相互抵消，于是⑴式可简化为：I0=Ia+It（2）透过光强度It与λ射光强度I0之比称为透光度或透光率。用T表示。即⑶溶液的透光度愈大，说明对光的吸收愈小；相反，透光度愈小，则溶液对光的吸收愈大。实践证明，溶液对光的吸收程度，与溶液的浓度、液层厚度以及入射光的波长等因素有关。如果保持入射光的波长不变，光吸收的程度则与溶液的浓度、液层厚度有关。（朗伯、比耳找出了它们的关系）2、朗伯定律当一束单色光通过溶液后，由于溶液吸收了一部分光能，光的强度就要减弱。0tIIT6设入射光的强度为I0，透过浓度为c，液层厚度为b的溶液，透过光的强度为It，由于一部分光被吸收，所以ItI0，如果溶液的浓度保持不变，当液层越厚时，光在溶液中通过的路程越长，则光被溶液吸收的程度就越大，透过光的强度就越小。照射在薄层上的光强度为I，当光线通过该薄层后，被吸收的光强度（即减弱的光强度）该式表示当溶液浓度一定时，光的吸收与液层厚度的关系，称为朗伯定律。A称为吸光度（也称光密度D或消光度E），该式说明了当溶液浓度一定时，光的吸收与液层厚度的关系，称为朗伯定律。3、比耳定律对于液层厚度一定而浓度不同的溶液（即颜色深浅不同的溶液）来说，光的吸收是与溶液的浓度（C）及入射光的强度成正比，即入射光的强度减弱的情况与浓度固定而改变厚度的情况完全相似。如图所示：如果用I表示透过光强度，则上式改为：或式中k4为比例常数，与入射光波长及溶液的性质、温度有关。比耳定律表明：当入射光的波长、液层厚度和溶液温度一定时，溶液的吸光度与溶液的浓度成正比。4、朗伯-比尔定律表达式bkT1lgIIlgA20ckIIlg40ckT1lgIIlgA407abcIIAt0lg或者，其中透光度0IIT(透射光强度I与入射光强度I0之比)TA1lg5、吸光系数、摩尔吸光系数和桑德尔灵敏度朗伯—比耳定律中的常数K值随c、b所用单位不同而不同，有两种表示方式。1.吸收系数a当浓度c的单位为g/L，液层厚度b用“cm”表示时，常数K以a表示，称为吸光系数。单位为L/g·cm。此时，朗伯—比耳定律变为：A=a·b·c2.摩尔吸收系数κ当浓度c的单位为mol/L，液层厚度b用“cm”表示时，则K用另一符号κ表示。κ称为摩尔吸光系数，单位为L/mol·cm。此时，朗伯—比耳定律为：A=κ·b·cκ表示浓度为1mol/L的有色溶液在1cm的比色皿中，在一定波长下溶液对光的吸收能力（即在一定波长下测得的吸光度数值）。它是每个有色化合物在一定波长下的特征常数，在比色分析中用它来衡量显色反应的灵敏度，κ值越大，则该显色反应越灵敏。例：已知含Fe2+浓度为500微克/升的溶液，用邻二氮菲比色测定铁，比色皿长度为2cm，在波长508nm处测得吸光度A=0.19，计算摩尔吸光系数。解：Fe原子量为55.856偏离朗伯—比尔定律的原因1)工作曲线：(mol/L)108.955.8510500][Fe6626108.92κκbc0.19A46101.1108.920.19κ8根据朗伯-比尔定律，当波长和强度一定的人射光通过光程长度固定的有色溶液时，吸光度与有色溶液浓度成正比。通常在比色分析及可见光分光光度分析中，需要绘制标准曲线(工作曲线)，即在固定液层厚度及人射光的波长和强度的情况下，测定一系列不同浓度标准溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标作图。这时应得到一条通过原点的直线。该直线称为标准曲线或工作曲线。在溶液浓度较高时，标准曲线不一定为直线。图分光光度工作曲线2)非单色光引起的偏离。非单色光引起的偏离朗伯-比尔定律的基本假设条件是入射光为单色光。但目前仪器所提供的入射光实际上是由波长范围较窄的光带组成的复合光。由于物质对不同波长光的吸收程度不同，因而引起了对比耳定律的偏离。3)化学因素引起的偏离。朗伯-比耳定律的基本假设，除要求入射光是单色光外，还假设吸收粒子是独立的，彼此之间无相互作用，因此稀溶液能很好地服从该定律。在高浓度时(通常0.01mol/L)由于吸收组分粒子间的平均距离减小，以致每个粒子都可影响其邻近粒子的电荷分布，这种相互作用可使它们的吸光能力发生改变。一般认为比耳定律仅适用于稀溶液。97.3紫外－可见分光光度计7.3.1、分光光度计及其基本部件将使用光电比色计测定溶液的吸光度以进行定量分析的方法称为光电比色法。将使用分光光度计进行测定的方法称为分光光度法。两种方法的测定原理是相同的，所不同的仅在于获得单色光的方法不同，前者采用滤光片，后者采用棱镜或光栅等单色器。由于两者均基于吸光度的测定，所以它们统称为光度分析法。光度计基本部件：光源、单色器、吸收池、检测系统图光度计的一般结构图721型分光光度计的构造101、光源：在可见光区测量时通常使用钨丝灯为光源。在近紫外区测定时常采用氢灯或氘灯产生180-375nm的连续光谱作为光源。2、单色器：滤光片-常用的滤光片由有色玻璃片制成，只允许和它颜色相同的光通过，得到的是近似的单色光。此外，还有一类利用光的干涉作用而产生相当窄的谱带的干涉滤光片，它可提供小到10nm宽的谱带和较大的透光度。棱镜-光通过人射狭缝，经透镜以一定角度射到棱镜上，在棱镜的两界面上发生折射而色散。色散了的光被聚焦在一个微微弯曲并带有出射狭缝的表面上，移动棱镜或移动出射狭缝的位置，就可使所需波长的光通过狭缝照射到试液上。3、吸收池(比色皿)比色皿，用于盛吸收试液，能透过所需光谱范围内的光线。在可见光区测定，可用无色透明、能耐腐蚀的玻璃比色皿，大多数仪器都配有液层厚度为0.5、1、2.5cm等的一套长方形或圆柱形比色皿。同样厚度比色皿之间的透光率相差应小4、检测系统检测系统测量吸光度时，并非直接测量透过吸收池的光强度，而是将光强度转换成电流进行测量，这种光电转换器件称为检测器。因此，要求检测器对测定波长范围内的光有快速、灵敏的响应，最重要的是产生的光电流应与照射于检测器上的光强度成正比。光电比色计及可见光分光光度计常使用硒光电池或光电管作检测器，采用检流计作读数装置，两者组成检测系统。目视比色法用眼睛比较溶液颜色的深浅以测定物质含量的方法，称为目视比色法。目视比色法特点：1)目视比色法的主要缺点是准确度不高，如果待测液中存在第二种有色物质，甚至会无法进行测定。2)由于许多有色溶液颜色不稳定，标准系列不能久存，经常需在测定时配制，比较麻烦。3)但设备简单，操作简便，比色管内液层厚使观察颜色的灵敏度较高，且不要求有11色溶液严格服从比耳定律，因而它广泛应用于准确度要求不高的常规分析中。127.4可见分光光度法一、显色反应及其条件的选择㈠显色反应和显色剂在分光光度分析中，很少利用金属水合离子本身的颜色进行光度分析，因为它们的吸光系数值都很小。一般都是选适当的试剂，首先利用显色反应把待测组分转变为有色化合物，然后进行测定。将待测组分转变为有色化合物的反应