基因工程(基因工程的基本条件-载体系统)

宋苏轼《桃花》基因工程淮阴师范学院杨文杰生物技术专业核心课程C用于基因转移的受体菌或细胞A用于核酸操作的工具酶B用于基因克隆的载体4基因工程的基本条件第二节基因工程的载体系统质粒载体噬菌体载体粘粒载体人工染色体载体载体的功能及特征一、克隆载体(一)载体的功能及特征载体:在基因克隆中携带外源基因进入受体细胞的基因工程“运载工具”称为载体。载体的化学本质是DNA。目前基因工程中使用的载体多为经过改造的质粒DNA。载体的概念载体应具备的基本特性：1.具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)；2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点；3.具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点；4.具有较高的外源DNA的载装能力；5.具有合适的筛选标记。(二)质粒载体(Plasmid)1.质粒的一般生物学特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子；质粒常见于原核细菌和真菌中；绝大多数的质粒是DNA型的；绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA；质粒DNA的分子量范围：1-300kb。2.质粒的分类R质粒：通称抗药性因子，它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且能够将此抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。F质粒：又叫F因子或性质粒，它们能使寄主染色体上的基因和F质粒一起转移到原先不存在该质粒的受体细胞。Col质粒：即所谓产生大肠杆菌素因子，它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌素是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。3.质粒的基本特性（1）自主复制（2）不相容性（3）转移性（4）编码性状（1）自主复制质粒DNA上都含有一个复制起始区，控制着质粒在宿主细胞内的复制，这一复制起始区称为“复制子”。一般一个质粒DNA分子上只含有一个复制子。不同质粒在宿主内复制的程度相差较大，体现在单个细胞内的质粒拷贝数上，最多的可高达700个/细胞，最低的在每个细胞中只维持有一个质粒分子。oriE.coliColE1plasmidrop（+）RopRNAIIRNAI3’5’5’3’拷贝数的控制机制–质粒DNA复制启动控制控制复制引物与模板的结合复制方向按复制能力可将质粒分为两种类型：严紧型（Stringentplasmid):低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有1-3个质粒分子松弛型（Relaxedplasmid):高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可含高达10-60个质粒分子（2）质粒的不相容性质粒的不相容性(Plasmidincom-patibility)：在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞系中稳定地共存的现象，又称为不亲和性。这样的两种质粒称为不亲和质粒。不相容性的质粒组成不相容性群,目前，在大肠杆菌质粒中至少已鉴定出了30个以上的不亲和群。质粒的接合转移接合型质粒:能在自然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等；（3）质粒的转移非接合型质粒:不能在自然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员。性须质粒的迁移作用（Mobilization)：非接合型的质粒由于分子小，不足以编码全部转移体系所需要的基因，因而不能自我转移。但如果在其寄主细胞中存在着一种接合型的质粒，它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型的质粒引发的非接合型质粒的转移过程，如ColE1质粒。质粒的迁移作用（4）编码性状野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状。物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物；物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱。这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。4.质粒载体的构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的。pSC101：8.8kb，拷贝数5，四环素抗性标记基因TcrColE1：6.5kb，拷贝数20-30，大肠杆菌内毒素标记基因E1RSF2124：ColE1衍生质粒，氨苄青霉素抗性标记基因Apr多克隆位点(MultipleCloningSites,MCS)现在几乎所有的载体都含有一个人工合成的密集排列的系列克隆位点，称为“多接头”、“限制酶切位点库”或“多克隆位点”。在质粒载体内引入适宜的限制性核酸内切酶位点，以方便外源DNA片段的插入。标记基因(MarkerGene)按其用途可将标记基因分为选择标记基因和筛选标记基因。选择标记基因用于鉴别目标DNA(载体)的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来；筛选标记基因可用于将携带了外源DNA片段的重组子挑选出来。选择标记基因1.氨苄青霉素抗性基因(Ampicillinresistancegene,ampr）2.四环素抗性基因（Tetracyclineresistancegene,Tcr）3.氯霉素抗性基因（chloramphenicolresistancegene,Cmr）4.卡那霉素基因（Kanamycinresistancegene,Kanr）筛选标记基因筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源DNA片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。互补lacZ’b-半乳糖苷酶的-肽段blacZb-半乳糖苷酶的b-肽段bbb-半乳糖苷酶lacZ’MCSb-半乳糖苷酶的-肽段bOHHHOHHOHHOHCH2OHONClBrClBrClBrONN5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal5-溴-4-氯靛蓝b宿主细胞可编码LacZ酶C端部分序列。虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补现象叫互补(-complement)。在质粒载体上带有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中含有b－半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码序列；在这一编码区中插入有一个多克隆位点，它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到LacZ酶的氨基端，而不影响功能；当外源片段插入到质粒的多克隆位点后，产生无互补能力的氨基端片段，因此，带有重组质粒的细菌形成白色菌落。由互补而产生的活性蛋白质在诱导物IPTG的存在下可与生色底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖苷）反应，因此Lac＋细菌在含X-gal和IPTG的培养基上可形成蓝色菌落，易于识别。人工构建的质粒类型：高拷贝质粒：突变拷贝数控制基因，拷贝数1000-3000，扩增基因；低拷贝质粒：来自pSC101，拷贝数小于10，表达某些毒性基因；温敏质粒：在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质；测序质粒：含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker；整合质粒：装有整合促进基因及位点，便于外源基因的整合；穿梭质粒：由人工构建的具有两种不同复制起始点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。；表达质粒：装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件；探针质粒：装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选；5.重要的大肠杆菌质粒载体第一阶段：pSC101和ColE1应用较多，但相对分子量大且酶切位点少；第二阶段：pBR322出现后，通过调整载体的结构，工作效率大大提高；pUC质粒去掉了多余的片段，添加了多克隆位点和筛选标记等；第三阶段：在此基础上，又增加了辅助功能，形成了表达载体和穿梭质粒等功能性质粒。pBR3224363bpOriginofReplicationROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIAprpBR322：4363bp；松弛型复制，50-100拷贝/cell；用于基因克隆30多个单一位点；具有Tcr和Apr；pUC18/19：分子量2686bp；装有多克隆位点(MCS)；正选择颜色标记lacZ’；用于基因克隆和测序。Rop基因缺失，500-700拷贝/cell；BamHIpUC182686bpAprlacZ'oriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIIIpGEM-3Z/4Z：拷贝数2000-3000/cell装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’装有两个噬菌体的强启动子用于外源基因的高效表达2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3ZPSP66.质粒DNA的分离与纯化氯化铯密度梯度离心法沸水浴法质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染碱溶法质粒DNA纯度底、快速、操作简便质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间proteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs氯化铯密度梯度离心法用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加CsCl和溴乙锭超速离心过夜在紫外灯下吸取cccDNA稀释沉淀cccDNA碱溶法在pH值在12.0-12.5之间时，线性染色体DNA片段会被变性，而闭合环状的质粒的DNA则不会被变性或只有少量的氢键断裂;当恢复中性pH值时便会迅速地复性。但变性的线性染色体DNA分子复性时不准确，也不迅速，因此彼此聚集形成网状结构,通过离心分离便与变性的蛋白质及RNA一起沉淀下来，而仍滞留在上清液中的质粒DNA则可用酒精等沉淀收集。cccDNAL-DNAocDNAD-DNA沸水浴法用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体；加溶菌酶裂解细菌细胞壁；沸水浴40秒钟；离心，用无菌牙签挑去沉淀物；乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA；(三)噬菌体载体(Bacteriophage)1.噬菌体的一般生物学特征噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率、高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增；大肠杆菌的λ噬菌体生物结构λ噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体；λ噬菌体由外壳包装蛋白和λ-DNA组成；λ-DNA全长48502个核苷酸；λ-DNA上至少有61个基因；COSCOS3’3’5’TCCAGCGGCGGGGCCCGCCGCTGGA5’cos头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因-DNAλ噬菌体生物学特性：感染周期E.coli吸附注入复制包装裂解λ噬菌体生物学特性：感染周期100个左右的拷贝体内包装包装范围为原DNA的75-105%即36-51kbλ噬菌体生物学特性：溶原状态λ噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态；整合主要由λ-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质；人们可以根据需要改变λ-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶原状态，或处于溶菌状态；DNA重组技术一般需要λ噬菌体进入溶菌状态。2.λ-DNA载体的构建缩短长度野生型λ-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型λ