基因工程7374610363

生物选修3现代生物科技专题标志：1973年重组DNA技术的诞生目录•专题1基因工程•专题2细胞工程•专题3胚胎工程•专题4生物技术的安全性和伦理问题•专题5生态工程专题1基因工程2010年7月7日基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。该技术是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。什么是基因工程？1.1DNA重组技术的基本工具1.2基因工程的基本操作程序1.3基因工程的应用1.4蛋白质工程的崛起专题1基因工程1.1DNA重组技术的基本工具准确切割DNA的工具（“分子手术刀”）——限制性内切酶DNA片段的连接工具（“分子缝合针”）——DNA连接酶基因转移工具（“分子运输车”）——运载体概述：切割DNA的工具是限制性核酸内切酶，又称限制酶。这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。一、限制性核酸内切酶—“分子手术刀”一、限制性核酸内切酶—“分子手术刀”特点：限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且在特定序列的特定的位点切割DNA分子。（专一性）例如：大肠杆菌(E.coli)的EcoRⅠ限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。黏性末端黏性末端如何切割DNA分子呢？DNA分子磷酸二酯键切割DNA分子实质是断开两个核苷酸之间的磷酸二酯键。一、限制性核酸内切酶—“分子手术刀”切割DNA分子后形成什么呢？产物：黏性末端（在中轴线两侧切割DNA）平末端（在中轴线处切割DNA）一、限制性核酸内切酶—“分子手术刀”GAATTCCTTAAGCCCGGGGGGCCCCTTAAGAATTCG黏性末端平末端CCCGGGGGGCCC限制性核酸内切酶能识别特定的核苷酸序列：1.酶的种类：二、DNA连接酶—“分子缝合针”（1）E·coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来。（2）T4DNA连接酶（噬菌体）两种酶的区别：（1）E·coliDNA连接酶（大肠杆菌）（2）T4DNA连接酶都能连接黏性末端和平末端，但连接平末端之间的效率比较低。2.酶的作用：将双链DNA分子片段“缝合”起来，恢复两个核苷酸之间的磷酸二酯键。二、DNA连接酶—“分子缝合针”AATTGCCTTAAG磷酸二酯键磷酸二酯键DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？•不是。两者的差别在于•（1）DNA聚合酶只能将单个的核苷酸加到已有的核酸片段的3‘末端的羟基上，形成磷酸二脂键，而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二脂键。•（2）DNA聚合酶是以一条DNA为模板，将单个核苷酸通过形成磷酸二脂键形成一条与摸板互补的DNA链；而DNA连接酶是将双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要摸板。要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是运载体。常用的载体是质粒，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。三、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”1、通常以质粒作为载体质粒——细菌细胞中一种很小的环状DNA分子。裸露的、结构简单、独立于细菌之外，并且有自我复制能力•质粒结构氨苄青霉素抗性基因质粒拟核大肠杆菌细胞目的基因插入位点复制原点作为基因工程运载体的条件①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。②具多种限制酶切点，以便与外源基因连接。③具有某些标记基因，便于进行筛选。④载体是安全的，不能对受体细胞有害。⑤载体DNA分子大小应合适，以便提取和在体外进行操作。。1.2基因工程的基本操作程序分为四个步骤1、从基因文库中获取将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。一、目的基因的获取基因组文库含有一种生物全部基因的基因文库部分基因文库含有一种生物部分基因的基因文库像国家图书馆像市图书馆如cDNA文库基因文库像“图书馆”每个基因是一本书①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：___________________、_______________、______(做启动子)、___________.②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为循环的次数）⑤结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增2、利用PCR技术扩增目的基因一、目的基因的获取⑥过程：a、DNA变性（95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性25℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（72℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链引物模板DNAdCTPdATPdGTPdTTP热稳定DNA聚合酶（Taq酶）DNA解链引物结合到互补DNA链Taq酶从引物起始进行互补链合成加热至70~75℃加热至90~95℃冷却至55~60℃若基因较小，核苷酸序列已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。3、人工合成一、目的基因的获取质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种1.过程:二、基因表达载体的构建复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因二、基因表达载体的构建三、将目的基因导入受体细胞转化——方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——用钙离子处理细胞（感受态细胞）目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达1、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法双子叶植物中常用方法（2）基因枪法（3）花粉管通道法单子叶植物常用的转化方法，成本较高我国独创的转化方法如：我国的转基因抗虫棉三、转化受体细胞显微注射技术注入的是含有目的基因的表达载体是转基因动物中采用最多、最有效的一种将目的基因导入动物细胞的方法。2、将目的基因导入动物细胞三、将目的基因导入受体细胞用原核细胞作为受体细胞的原因？繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等大肠杆菌应用最为广泛大肠杆菌细胞最常用的转化方法：Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA溶于缓冲液中与感受态细胞混合→在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子→完成转化过程。3、将目的基因导入微生物细胞三、将目的基因导入受体细胞DNA分子杂交示意图采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。四、目的基因的检测和鉴定四、目的基因的检测和鉴定（一）首先要检测转基因生物染色体上的DNA上是否插入了目的基因检测方法是采用DNA分子杂交技术DNA—DNA（二）其次，还需要检测目的基因是否转录出了mRNA这是检测目的基因是否发挥功能的第一步检测方法是采用分子杂交技术DNA—mRNA——检查是否成功检测（分子水平）—鉴定（个体水平）——①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）抗原抗体杂交（抗原是转基因生物中提取的蛋白质，若出现杂交带，说明形成了目的基因对应的蛋白质）四、目的基因的检测和鉴定第三节基因工程的应用一、基因工程的应用二、转基因生物的安全性问题三、生物武器的危害性1、抗虫转基因植物——从某些生物中分离出具有杀虫活性的基因，将其导入作物中，使其具有抗虫性。已问世的转基因抗虫植物主要有水稻、棉、玉米、马铃薯、番茄、大豆、蚕豆、烟草、苹果、核桃、杨、菊花和白花三叶草等。用于杀虫的基因主要是：Bt毒蛋白基因蛋白酶抑制剂基因淀粉酶抑制剂基因植物凝集素基因等例如，我国转基因抗虫棉就是转入Bt毒蛋白基因培育出来的，它对棉铃虫具有较强的抗性。一、转基因植物2、抗病转基因植物引起植物生病的微生物称为病原微生物，主要有病毒、真菌和细菌等。目前，人们已获得抗烟草花叶病毒的转基因烟草和抗病毒的转基因小麦、甜椒、番茄等多种作物。用于抗病转基因植物的基因主要是：病毒外壳蛋白（CP）基因病毒的复制酶基因用于抗真菌转基因植物的基因主要是：几丁质酶基因和抗毒素合成基因3、其它抗逆转基因植物利用调节细胞渗透压的基因，来提高农作物的抗盐碱和抗干旱的能力。将鱼的抗冻蛋白基因导入烟草和番茄，使烟草和番茄的耐寒能力均有提高。将抗除草剂基因导入大豆、玉米等作物，喷洒除草剂时，杀死田间杂草而不损伤作物。4、利用转基因改良植物的品质将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因，导入植物中，或者改变这些氨基酸合成途径中某种关键酶的活性，以提高氨基酸的含量。富含赖氨酸的转基因玉米用基因重组蓝玫瑰将控制番茄果实成熟的基因导入番茄，获得转基因延熟番茄。将与植物花青素代谢有关的基因导入花卉植物矮牵牛中，转基因矮牵牛呈现出自然界没有的颜色变异。1、用于提高动物生长速度将外源生长激素基因的表达可以使转基因动物生长得更快。转生长激素基因鲤鱼转生长激素基因绵羊二、转基因动物超级小鼠转生长激素基因鲤鱼2、用于改善畜产品的品质例如，有些人对牛奶中的乳糖不能完全消化或食用后会出现过敏、腹泻、恶心等不适症状，科学家将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，使获得的转基因牛分泌的乳汁，在其他营养成分不受影响的情况下，乳糖的含量大大减低。乳腺生物反应器：目前科学家已在牛和山羊等动物乳腺生物反应器中表达畜了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和α抗胰蛋白酶等重要医药产品。3、用转基因动物生产药物4、用转基因动物作器官移植的供体将器官供体基因组导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，在结合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。这些药物包括细胞因子、抗体、疫苗、激素。如胰岛素、白细胞介素－2、干扰素、乙肝疫苗等近20种基因工程药物基因治疗使把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。三、基因工程药物异军突起四、基因治疗曙光初照生产干扰素的车间体外基因治疗先从病人体内获得某种细胞，进行培养，然后，在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。（效果较为可靠）体内基因治疗直接向人体组织细胞中转移基因的治病方法4蛋白质工程何谓蛋白质工程？•在现代生物技术中，蛋白质工程出现得最晚，是在20世纪80年代初期出现的。1983年“蛋白质工程”这个名词出现后，随即被广泛接受和采用。蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础,通过基因修饰或基因合成,对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的蛋白质,以满足人类的生产和生活的需求。二、蛋白质工程的基本原理蛋白质工程的主要步骤通常包括：（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2）测定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；（5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。三、蛋白质工程的进展和前景蛋白质工程汇集了当代分子生物学等学科的一些前沿领域的最新成就，它把核酸与蛋白质结合、蛋白质空间结构与生物功能结合起来研究。蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭新的时代，为蛋白质和酶在工业、农业和医药方面的应用开拓了诱人的前景。蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造