基因工程专题1-4课时复习课用共2课时上完

基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外和等技术，赋予生物以新的，创造出更符合人们需要的新的生物和生物。基因工程的别名基因拼接技术或DNA重组技术操作环境生物体外操作对象操作水平基本过程结果人类需要的基因产物基因DNA分子水平基因表达载体的构建目的基因的获取目的基因的检测与鉴定导入受体细胞DNA重组转基因遗传特性类型产品基因工程的概念基础理论和技术的发展催生了基因工程DNA是遗传物质的证明DNA双螺旋结构和中心法则的确立遗传密码的破译基础理论技术发明基因转移载体的发现工具酶的发明DNA合成和测序技术的发明DNA体外重组的实现重组DNA表达实验的成功第一例转基因动物问世PCR技术的发明DNA重组技术的基本工具•限制性核酸内切酶——“分子手术刀”•DNA连接酶——“分子缝合针”•基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”限制性核酸内切酶——“分子手术刀”主要在原核生物中特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点磷酸二酯键EcoRI限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开分布：作用特点：切点：举例：限制性内切酶限制酶限制酶所识别的序列有什么特点•限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。DNA连接酶——“分子缝合针”•连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E·coli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。•这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。•E·coli连接酶只能连接黏性末端；T4连接酶既可“缝合”黏性末端，又可“缝合”平末端。基因的载体——“分子运输车”载体必须具备的条件：1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；2、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；3、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等）4、对受体细胞无害载体的作用：1、将外源基因转移到受体细胞中去。2、利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。常用的载体有：质粒，λ噬菌体的衍生物，动植物病毒等（一）目的基因的获取1、目的基因：编码蛋白质的基因（1）从基因文库获取：用限制酶切割DNA,形成许多DNA片段（基因组文库)（2）人工合成法：①反转录法：用mRNA反转录出DNA片段（cDNA）②化学合成法：根据蛋白质的氨基酸序列，推测mRNA序列，再推测DNA序列，然后人工合成DNA（cDNA）2、基因文库:（1）基因组文库:一种生物所有的基因（2）部分基因文库:一种生物的部分基因（cDNA）3、获取方法：①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：________、_______________、___________、___________.前提条件：②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：选修1P60聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增（3）利用PCR技术扩增目的基因模板⑥过程：a、变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、复性（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链3′端1.用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。2.用_____________切断目的基因，使其产生_________________。——核心3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同(二)基因表达载体的构建基因表达载体的组成：复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因启动子：结合RNA聚合酶开始转录mRNA终止子：位于基因尾端终止转录mRNA标记基因：鉴别目的基因是否导入(筛选)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。(三)将目的基因导入受体细胞转化——导入方法动物细胞——显微注射法(受精卵)微生物细胞——感受态细胞（Ca2+）植物细---目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞表达稳定农杆菌转化法花粉管通道法基因枪法1、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法特点:能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌2、将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（2）程序：3、将目的基因导入微生物细胞（1）原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少（2）方法：目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子(四)目的基因的检测与鉴定检测鉴定——①检测染色体的DNA上是否插入目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等DNA探针和目的基因单链杂交方法：DNA分子杂交方法:分子杂交方法：抗原抗体杂交DNA探针和目的基因的mRNA杂交——检查是否成功DNA分子杂交示意图采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。三、基因工程的应用抗虫、抗病、抗逆、改变品质（一）植物基因工程1、加快生长、改善品质（二）动物基因工程2、生产药物（乳腺反应器）3、器官移植（供体）（三）基因工程药品（工程菌：外源基因高效表达的菌系）（四）基因诊断和基因治疗基因诊断：用标记探针通过DNA分子杂交，鉴定遗传信息基因治疗：把正常基因导入病人体内表达，发挥正常功能体外基因治疗、体内基因治疗（五）基因工程与环境保护环境监测（DNA探针检测微生物）污染治理（超级细菌）抗虫基因Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等抗病毒基因病毒外壳蛋白（coatprotein，CP）基因；病毒的复制酶基因抗真菌基因几丁质酶基因和抗毒素合成基因抗逆基因调节细胞渗透压的基因、抗冻蛋白基因、抗除草剂基因优良性状基因提高必需氨基酸含量的蛋白质编码基因、控制番茄果实成熟的基因、与植物花青素代谢有关的基因转基因植物肠乳糖酶基因外源生长激素基因提高动物生长速度改善畜产品的品质生产药物药用蛋白质基因+乳腺蛋白基因的启动因子作器官移植的供体导入外源的抗原决定基因表达的调节因子，抑制或除去供体的抗原决定基因转基因动物用基因工程方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系。基因工程药品包括：细胞因子（即淋巴因子如白细胞介素—2、干扰素）、抗体、疫苗、激素等工程菌:①获取目的基因（例如血清白蛋白基因）②构建基因表达载体（在血清白蛋白基因前加特异表达的启动子）③显微注射导入哺乳动物受精卵中④形成胚胎⑤将胚胎送入母体动物⑥发育成转基因动物（只有在产下的雌性个体中，转入的基因才能表达）。实例:基因工程实现动物乳腺生物反应器的操作步骤将目的基因导入到动物的受精卵里，目的基因若与受精卵染色体DNA整合，细胞分裂时，该基因随染色体的倍增而倍增，使每个细胞中都带有目的基因，使性状得以表达，并稳定地遗传给后代，从而获得基因产品。这样一种新的个体，称为转基因动物。总结：转基因动物基因工程在畜牧养殖业上的应用主要是什么？繁殖具有抗病能力、高产仔率、高产奶率和高质量的皮毛等优良品质的转基因动物。该过程的重要步骤是通过感染或显微注射技术将重组DNA转移到动物受精卵中。1.基因治疗是把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。取患者骨髓分离干细胞病毒正常基因并入正常基因的干细胞注入患者体内基因治疗曙光初照2.实例：将腺苷酸脱氨酶基因转入取自患者的淋巴细胞中，再将这种淋巴细胞转入患者体内。(1)治疗严重复合型免疫缺陷症利用修饰的腺病毒作载体，将治疗遗传性囊性纤维化病的正常基因转入患者组织中(2)治疗遗传性囊性纤维化病3、基因治疗的类型体外基因治疗：先从病人体内获得某种细胞，进行培养，然后在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。体内基因治疗：直接向人体组织细胞中转移的治病方法。（如将治疗囊性纤维病的正常基因转入患者肺组织）4、基因治疗的发展现状：处于初期的临床试验阶段五、基因芯片从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱；从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。一、蛋白质工程崛起的缘由满足人类生产和生活的需要例如：改造干扰素（半胱氨酸）体外很难保存干扰素（丝氨酸）体外可以保存半年玉米中赖氨酸含量比较低天冬氨酸激酶（352位的苏氨酸）二氢吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）改造改造天冬氨酸激酶（异亮氨酸）二氢吡啶二羧酸合成酶（异亮氨酸）玉米中赖氨酸含量可提高数倍四、蛋白质工程1、基因工程的不足：只能生产天然蛋白质2、天然蛋白质不足：不完全符合人类需要提高酶的热稳定性、延长药用蛋白的保存期基因表达（转录和翻译）多肽（氨基酸序列）蛋白质（空间结构）行使功能天然蛋白质的合成预期蛋白质功能设计蛋白质结构推测氨基酸序列找到核苷酸序列蛋白质工程途径3、原理：预期蛋白质功能、找到相应DNA序列（第二代基因工程）2.对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？答：毫无疑问应该从对基因的操作来实现对天然蛋白质改造，主要原因如下：（1）任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的。（2）对基因进行改造比对蛋白质直接改造要容易操作，难度要小得多。旁栏思考题蛋白质工程流程图找到相应的核苷酸序列推测氨基酸序列设计预期蛋白质三维结构预期蛋白质功能DNA合成蛋白质工程的概念：是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（第二代基因工程）蛋白质工程的基本原理蛋白质工程的内容主要有两方面：一是根据需要设计具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质二是确定蛋白质的化学组及空间结构与生物功能之间的关系，在此基础上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生理功能，设计合成具有特定生物功能的全新蛋白质，而氨基酸排序由基因决定，所以还需要改造控制蛋白质合成的相应基因中脱氧核苷酸序列或人工合成所需要的自然界原本不存在的基因片段，用与蛋白质工程。蛋白质工程的进展与前景•蛋白质工程目前的现状：成功的例子不多，主要是因为蛋白质发挥其功能需要依赖于正确的空间结构，而科学家目前对大多数蛋白质的空间结构了解很少。作业:蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程有什么不同?蛋白质工程与基因工程相比,合成的蛋白质有何特点?实例：利用基因工程技术生产人胰岛素人胰岛细胞大肠杆菌胰岛素mRNAA①人胰岛素人胰岛素大量的A重复进行③④②⑤⑥⑦⑧⑨⑩BCD2.过程②必需的酶是酶，过程③一般用方法是氢键断裂，也可以用酶处理。4.为使过程⑧更易进行，可用（药剂）处理D。3