基因工程在转基因动物领域的应用现状及展望

生命科学院分子生物学期末综述题目：基因工程在转基因动物领域的应用现状及展望班级：09动物科学姓名：曾雪婷学号：2009084548【摘要】本文阐述了基因工程和转基因技术研究的原理、基本路线，介绍了转基因技术和生产转基因动物的方法，总结转基因技术在哺乳动物领域的应用，提出了转基因动物面临的问题，并对转基因技术及转基因动物的前景进行了展望。【关键词】基因工程；原理；转基因动物；应用；展望基因工程是改变生物的遗传组成，增加生物的遗传多样性，赋予转基因生物新的表型特征，使其能够更好地服务于人类社会的一项工程技术。基因工程在转基因动物领域的应用具有巨大的发展潜力，促进了转基因方法的不断发展和转基因动物应用领域的迅速扩大。1.基因工程与动物基因工程的原理基因工程又名遗传工程(geneticengineering)、一主要包括DNA重组技术、分子克隆或基因克隆等技术，它是指在分子水平上提取(或合成)不同生物的遗传物质，在体外切割，再和一定的载体拼接重组，然后把重组的DNA分子引入细胞或生物体内，使这种外源DNA(基因)在受体细胞质中进行了复制与表达，按人们的需要繁殖扩增基因或生产不同的产物或定向创造生物的新性状，并能稳定遗传给后代[1]。基因工程的核心内容包括基因克隆和表达。动物基因工程就是利用基因工程技术来人为地改造动物遗传特性的技术体系。它的具体应用就是生产转基因动物(transgenicanimal)，即用基因工程的方法获得目的基因并导入到动物的受精卵中，使外源基因与动物本身的基因组DNA整合到一起，并随细胞的分裂而增殖，从而在动物体内得到表达，产生具有特定性状的个体。这种在基因组中稳定有效地整合有人工导入外源基因的动物称转基因动物。应用实验胚胎学和分子生物学原理，将来自一种生物的特定基因导人另一动物的受精卵或早期胚胎细胞中，并整合到宿主染色体中，在动物发育过程中表达，并能通过生殖细胞传递给后代。其基本程序为：目的基因的制备——目的基因的导入——感染外源基因供体的培养——筛选外源基因的供体检验——受体细胞的准备——转基因重组胚的构建——转基因重组胚的培养——转基因重组胚胎的移植——产下转基因动物——转基因动物鉴定——生殖细胞传递给后代。转基因动物的出现引起了世人的瞩目。2.转基因技术的应用领域2.1转基因技术在哺乳动物遗传育种领域的应用转基因技术完全可以按照人类的主观愿望设计目的基因及其表达产物，通过定向精心培育，使物种符合人类经济目的的变异，能加快其积累和保存的步伐。在畜牧业生产上，主要是用于遗传改良，加速动物育种，研究真核生物基因表达调控机理。当出现符合我们预想结果的转基因动物时，再利用优良动物品种的体细胞作核供体克隆动物，用于大量生产转基因动物。利用转基因技术可以很快地在实验室创造出新物种。在动物杂种优势利用方面，可增强选育的种畜性状稳定，提高育种效率，大大缩短育种年限，加速动物育种的进程。另外，对于家畜可以做基因工程改造，将结合特异抗原抗体基因转入动物体内，制造出对细菌、病毒及寄生虫等疾病具有遗传免疫特性的转基因抗性动物。2．2转基因技术在生物制药领域的应用目前，转基因动物的乳腺可以用作生产医用蛋白，提高转入基因(如κ-酪蛋白基因)以及一些激素(如生长激素)及酶(如转乳糖酶基因)的基因表达的经济有效的生物反应器，即通过乳腺生物反应器可得到治疗一些疑难病症的药物。把一些目的基因(即能够产生治疗某种疾病特效物质的基因)注射到一个奶牛受精卵的原核里，通过基因整合、胚胎发育，再将其移人母体子宫中继续发育成后代，在雌性性成熟后的乳汁中提取有用的药物。这种方法整合率低，乳腺里的表达量很低，得不到理想的药物。现在可利用转基因技术结合克隆技术来生产乳腺生物反应器。首先把目的基因整合到体细胞、成纤维细胞或胚胎干细胞中培养，再筛选出高表达量的细胞进行克隆，其后代动物乳腺里就有高表达量的蛋白质。即动物成为“制药厂”。2003年，Brophy等[2]通过转基因克隆技术使牛奶中β-伊酪蛋白的含量提高了8％～20％，κ-酪蛋白的含量提高了两倍。由此表明，通过转基因的方法利用乳腺生物反应器来生产转基因生物制剂具有极大的开发潜力。2．3转基因技术在建立动物模型和器官移植等医疗领域的应用转基因鼠是人类疾病的动物模型，它可以帮助人们深入了解复杂疾病的病因和发展过程。科学家们已经建立了包括老年性痴呆症、关节炎、肌肉营养缺乏症、肿瘤发生、高血压、神经衰变症、内分泌功能障碍、动脉硬化症等疾病鼠模型[3]。在器官移植方面，研究者成功敲除α-1，3-半乳糖苷酶基因的猪，这为人类异体器官移植的设想带来了曙光。3.转基因动物3．1转基因动物的研究方法利用转基因技术培育新品种既可以加快家畜品种的改良速度，提高肉，奶、蛋的产量和品质，又可以生产珍贵的药用蛋白。常用的制备转基因动物的方法主要有：原核期胚胎的显微注射法(genmicroiniectioninpronucleus’embryo)；逆转录病毒感染技术(retrovirus-mediatedgenetransfer)；精子载体法(sperm-mediatedgenetransfer)；生殖细胞转染法(germcell—mediatedgenetransfer)；胚胎干细胞(ES)技术及原始生殖细胞(PGCs)技术(embryostemcell／primordialgermcells—mediatedgenetransfer)；受体介导的基因转移(recipient—mediatedgenetransfer)等。DNA显微注射法、胚胎干细胞介导法和转基因体细胞克隆技术足目前转基因动物研究中常用的方法[4]。随着研究的深入，动物转基因技术已从简单的显微注射法向高效率的转基因体细胞核移植方向发展，从外源基因随机插入(或整合)到定点整合的转变，从传统转基因到条件控制的转变。3．2转基因动物生产的技术方法转基因动物技术始于20世纪80年代，随着研究的深入，转基因动物的制作技术得到了突破性进展。现已建立了许多融合有外源基因的转基因小鼠和大鼠，转基因兔、猪、羊、牛等已诞生[5]。目前常用DNA显微注射法、胚胎干细胞介导法和转基因体细胞克隆技术生产转基因动物。3．2．1DNA显微注射法生产转基因动物1990年12月，美国GenpharmInternational公司用酪蛋白启动子与人乳铁蛋白(humanLactoferrin，hLF)的cDNA构建了转基因载体，通过显微注射法获得了世界上第一头名为Herman的转基因公牛。该公牛与非转基因母牛生产的转基因后代，1／4后代母牛乳汁中表达了人乳铁蛋白含量达1000ug／mL。2002年，Berkel等利用牛asl-酪蛋白启动子与人乳铁蛋白基因组6．2kb片段构建转基因载体，通过显微注射获得了转基因牛。ELISA(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay)结果分析表明，转基因牛奶中人乳铁蛋白的含量为300～2800ug／mL。这一研究结果表明，可以用转基因牛生产人乳铁蛋白。3．2．2胚胎干细胞介导法生产转基因动物利用胚胎干细胞可以在体外培养和便于基因操作的优点，用自体细胞核内的遗传物质生产完全相同的胚胎干细胞，用特定的物质进行处理和诱导，得到所需要的各种组织细胞，再送回人体便能够修补和更新因疾病或老化而受损的器官组织。此构想已经初步在小鼠以及大型哺乳类上试验成功。将转基因技术与干细胞技术结合产生的胚胎干细胞，结合基因敲除(geneknock-out)和基因导人(geneknock-in)等手段，进行基因定点整合实验，创建动物疾病实验医学模型和治疗遗传疾病及作为医用器官移植的供体等方面，有望成为医学领域新颖的治疗途径。人的异种器官移植的主要问题在于克服致命的超急性排斥反应。排斥反应是由人体内抗体通过结合到猪血管内的半乳糖而引发，会导致植入器官在被移植后几分钟到几小时内被破坏掉。因而防止排斥的最直接方法是将供体动物的a-1，3-半乳糖转移酶基因敲除掉。但真正将猪器官临床应用到人体内前，还须考虑猪内源性病毒传播给人类的潜在危险，基因打靶是目前解决此问题的有效探索。3．2．3转基因体细胞克隆技术生产转基因动物PPL公司在Dolly绵羊诞生的同年，由Schnieke等共同合作得到了用于治疗血友病的第一批携带外源基因——人凝血因子(IX)：HumanFactorⅨ基因的克隆绵羊，凝血因子Ⅸ可在乳中的表达量达到125ug／mL。Cibelli等用标记物β-gal／neo对雄性牛胎儿的成纤维细胞进行转染，再经新霉素筛选所得到抗性细胞克隆获得都在同一个染色体位点整合了外源基因β-半乳糖苷酶的4头小牛。Baguisi等克隆得到高效表达人抗凝血因子Ⅲ的转基因山羊。McGreath等获得第一只定点整合外源基因的转基因克隆绵羊；Lai等用G2／M期细胞做核供体得到表达绿色荧光蛋白的小猪；同年Lai等成功得到敲除a-1，3-半乳糖苷转移酶基因的克隆猪。目前国内已经有许多课题组掌握了体细胞克隆技术和转基因克隆技术，成勇等[6]以转基因山羊体细胞为供体细胞克隆出转基因山羊。龚国春等[7]获得了第一头转基因克隆牛。石德顺研究员领导的课题组正在进行转基因克隆水牛的研究，已经建立了基因打靶的技术平台，获得了转人a-乳清蛋白、TPO基因的克隆水牛胚胎；中国农业大学李宁教授获得一批转有人体基因的转基因克隆奶牛，转基因克隆胚胎的移植受体牛妊娠率达到33．3％(国际水平30．7％)；转基因克隆胚的移植受体牛产犊率达到37．5％(国际水平11．5％)，因此，我国转基因体细胞克隆牛生产的总体效率达到了10％，转基因体细胞克隆牛技术达到国际前沿水平。我国是继美国之后第二个拥有高效转基因克隆牛技术的国家，这促使我国转基因动物新品种培育效率大幅提高。4.转基因技术目前出现的问题及分析尽管转基因动物研究和应用取得了重大进展，同时也面临着不少的问题和困难。目前出生的转基因动物定点整合效率低，外源基因表达不稳定，成本昂贵；对家畜染色体上控制众多经济性状的基因位置知道不多，动物的生产性状的基因由多基因控制，难以实现同时对大批基因的转移；控制各种主要性状的基因在宿主表达(受体)组织内特异性表达的调控因子和启动因子尚未完全发现；其食品及产品的安全性问题也引起了世人关注。2007年，Yang等首次对克隆牛与非克隆牛的生物化学组分进行了分析，表明两者在生物安全评价指标上没有大的差异。同年，Laible等在分析了转基因和克隆奶牛的奶样和奶酪的化学成分后得出结论，克隆牛与传统育种获得的牛奶各项指标含量基本一致和类似，转有酪蛋白基因的奶牛初乳与正常奶牛的IgG含量和动态变化趋势类似。随着转基因技术进一步深入研究和推广应用，转基因技术在动物应用方面存在的一些问题会逐渐被攻克，技术会更加日趋成熟完善。转基因动物被更多的人们认可和接受，其应用也将更加广泛。5.转基因技术的发展前景基因工程技术以其巨大的生命力影响着人类的生活，并已逐步渗透到人类生活的各个领域。随着转基因技术领域的不断拓展，在实验室获得的新突破和技术成果不断地运用到生产实践中去，创造出更多具有优良经济性状的不同种类的转基因动物，使地球的生物圈变得更加丰富多彩。转基因技术的出现与发展为研究动物改良、抗病育种方面，探明人类疾病发病机理研究以及建立人类遗传疾病的转基因动物模型，建立动物生物反应器来生产天然活性药物蛋白和基因治疗以及生产人类器官代用品等方面极具有开发潜力，转基因技术的成熟和推广将给人类带来无限光明。参考文献：[1]李立家．肖庚富．基因工程[M]．北京：科学出版社，2004：1．[2]BROPHYB，SMOLENSKIG，WHEELERT·etal．Clonedtransgeniecattleproducemilkwithhigherlevelsofbeta-caseinandkappa-casein[J]．NatBioteehn01．2003．21(2):157—162．[3]瞿礼嘉，顾红雅，胡苹．现代生物技术[M]．北京，高等教育出版社，2004：310．[4]孙明