基因工程的基本操作程序最终

1-2：基因工程的基本操作程序专题1：基因工程原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区非编码区②有调控遗传信息表达的核苷酸序列：启动子、一段有特殊结构的DNA片断，基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合部位，驱动基因转录——启动子终止子一段有特殊结构的DNA片断，基因的尾端，使转录终止——终止子真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游编码区非编码区能编码蛋白质的序列非编码序列：包括非编码区和内含子不能编码蛋白质的序列内含子：外显子：①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质②有调控遗传信息表达的核苷酸序列：启动子、终止子原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取主要是编码蛋白质的结构基因基因工程基本操作的步骤如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。二、获取目的基因的常用方法有哪些?（一）从基因文库中获取（二）利用PCR技术扩增（三）人工合成（一）从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。1、分类基因文库（genelibrary）基因组文库部分基因文库（如cDNA文库）基因组文库:包含了一种生物所有的基因的基因文库部分基因文库:包含了一种生物的一部分基因的基因文库部分基因组文库cDNA(互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库如cDNA文库(cDNAlibrary)基因重组反转录酶mRNAcDNAcDNA文库和基因组文库的对比2.基因文库的构建方法1.从生物中直接获取2.人工合成（真核生物）(1)反转录法(2)化学合成法：根据已知的氨基酸序列合成DNA法：鸟枪法，多用于原核生物1.直接分离基因——鸟枪法（散弹射击法）运载体供体细胞中DNA许多DNA片段载入导入受体细胞产生特定性状目的基因分离外源DNA扩增该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。用限制酶切断成许多片段。目的基因的mRNA单链cDNA反转录酶双链DNA（即目的基因／双链cDNA）DNA聚合酶(1)反转录法蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因推测化学合成推测2.人工合成基因法(2)化学合成法：根据已知的氨基酸序列合成DNA法合成的基因中均无内含子和启动子杂交双链（RNA-DNA)核酸酶H•上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点缺点鸟枪法反转录法根据已知氨基酸合成DNA法操作简便广泛使用工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因专一性强操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高专一性强仅限于合成核苷酸对较少的简单基因如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性。3、基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。已知目的基因序列时2、人工合成：基因比较小，核苷酸序列已知DNA合成仪3、PCR技术扩增目的基因：PCR——聚合酶链式反应是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。循环变性退火延伸①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：_______________________前提条件_______________、___________、___________.②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：多聚酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制一段已知目的基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物热稳定DNA聚合酶（Taq酶）指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增(二)利用PCR技术扩增目的基因⑥过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链d、循环1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。二、基因表达载体的构建——基因工程的核心2、基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因+复制原点目的基因：外源DNA分子的有效片段启动子：RNA聚合酶识别和结合部位，驱动基因转录出mRNA终止子：提供转录终止信号标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因复制原点：DNA复制的固定起始点二、基因表达载体的构建——核心质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达（二）方法1、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法①农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。③过程：④优点:比较经济和有效（2）基因枪法（3）花粉管通道法2、将目的基因导入动物细胞①方法：显微注射法②程序：目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物胚胎早期培养3、将目的基因导入微生物细胞①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少②方法：感受态细胞法（Ca2+处理法）用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子四、目的基因的检测与鉴定——检查是否成功（一）、检测1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因①.首先取出转基因生物的基因组DNA②.将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针③.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中（1）方法:DNA分子杂交（2）过程:归纳步骤4、个体生物学水平鉴定2、检测目的基因是否转录出了mRNA3、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等①方法:分子杂交方法:抗原抗体杂交②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA归纳步骤归纳:基因工程的基本操作程序1、获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成2、构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因3、将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法、感受态细胞法4、目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：个体水平的鉴定练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的处，DNA连接酶作用于处。（填“a”或“b”）aa1．基因工程的正确操作步骤是()①使目的基因与载体相结合②将目的基因导入受体细胞③验证目的基因的表达是否符合特定性状要求④提取目的基因A．③②④①B．②④①③C．④①②③D．③④①②C2．下列获取目的基因的方法中需要模板的是()①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③反转录法④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成DNAA．①②③④B．①②③C．②③④D．②③D3．聚合酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述30多次循环：95℃下使模板DNA变性、解链→55℃下复性(引物与DNA模板链结合)→72℃下引物链延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是()A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸D．PCR与细胞内DNA复制相比所需酶的最适温度较高C4．(2011年重庆高二检测)下列关于基因表达载体构建的相关叙述，不正确的是()A．需要限制酶和DNA连接酶B．必须在细胞内进行C．抗生素抗性基因可作为标记基因D．启动子位于目的基因的首端B我国中科院上海生化所合成了一种具有镇痛作用而又不会像吗啡那样使病人上瘾的药物——脑啡肽多糖(类似于人体中的糖蛋白)。在人体细胞中糖蛋白必须经过内质网和高尔基体的进一步加工才能形成。如果要采用基因工程和发酵工程技术让微生物来生产脑啡肽多糖，应该用下列哪种微生物作受体细胞()A．大肠杆菌B．酵母菌C．T4噬菌体D．大肠杆菌质粒B