基因工程第三章2-Jun-finalversion

CloningVectors第三章基因工程载体第三章基因克隆载体第一节质粒载体第二节噬菌体载体第三节真核细胞的克隆载体第二节噬菌体载体•一、噬菌体的一般生物学特性•二、λ噬菌体载体•三、粘性质粒•四、单链DNA噬菌体载体一、噬菌体的一般生物学特性噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的“寄生虫”。它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。噬菌体的结构•烈性噬菌体•温和噬菌体•溶源化细菌•溶源化•原噬菌体噬菌体的侵染与包装二、λ噬菌体载体λ噬菌体的电子显微镜照片a)在噬菌体内呈线性双链DNA分子(48502bp)，编码50多个基因，在两端各有12个碱基组成的5’单链互补粘性末端(Cohesiveend),进入宿主细胞后,粘性末端连接形成环状分子(Cos位点)，是包装的必需DNA序列．5’-GGGCGGCGACCTXX…XXG-3’XX…XXCCCCGCCGCTGGA-5’b)λ基因组DNA上有56种限制酶识别位点．1.λ基因组DNA的特点（一）λDNA分子λ噬菌体基因大致分为4个区：结构区A～J19个基因，编码头、尾部蛋白质为结构区,重组区att（attachment）、int（intagrate）及xis（excission），调控区启动子、终止子和NCI基因，O-R为裂解区.λ噬菌体的基因组图及EcoRI酶切图2.λ基因组DNA的结构A：成熟包被，切开cos环，D,E：(占头蛋白75%)W,F：头尾连接Int(整合),Xis(删除),Red促重组N(早期调控)促O,P(复制).Red,Xis,Int转录和整合。Q(晚期调控)促头,尾,S,R基因表达和溶菌CI,CII,CIII为负调控，阻止溶菌环化后的λ基因组DNA•人为将λ噬菌体基因组分为3个区域：–左侧区：自基因A到基因J，包含外壳蛋白的全部编码基因。–中间区：介于基因J和基因N之间，这个区又称为非必需区，与噬菌斑形成无关，被外源DNA片断取代后，并不影响噬菌体的生命活动。中间区包含重组基因和整合切割基因。–右侧区：位于N基因的右侧，包含全部的主要调节基因及复制基因和裂解基因。•裂解周期–早期：环状的λDNA分子按θ型双向复制，复制起点位于O基因内，需要O、P基因编码蛋白的参与。–晚期：控制滚环型复制的开关被启动，复制从θ型转变为滚环型复制，合成出一系列λDNA线性排列的多聚体分子。–cos位点是λ噬菌体正确包装的必需位点。3.λDNA的复制λ噬菌体DNA的复制•溶原性周期–λDNA复制以另外一种形式进行，稳定的整合到宿主染色体上并随之一起复制。–cI基因表达，合成参与溶菌周期活动的所有基因被阻遏的蛋白质。–附着位点att，同大肠杆菌染色体DNA的局部同源位点之间的重组反应实现。•原噬菌体的删除作用–整合作用需要int基因的表达，是一种可逆的过程：一方面，噬菌体基因组可以整合到大肠杆菌染色体DNA上，成为原噬菌体；另一方面，在适当条件下，原噬菌体又可以脱离宿主染色体，重新变成独立的复制子，这种过程叫做原噬菌体的删除作用。–λ噬菌体的删除，需要噬菌体xis基因和int基因的协同作用才能实现。4.λ噬菌体的组装1.野生型的λ噬菌体不适于直接用作基因克隆载体原因–λDNA基因组中同一种限制酶具有多个识别位点，不利于外源DNA插入—体内突变和建立新的克隆位点。–包装限制:λ噬菌体头部只能容纳自身DNA的75-105%，即39-52.5Kb，天然λ仅可插入2.5Kb外源DNA片段—如若除去所有与λ裂解无关的基因和空白区，最大可插入22Kb。（二）λ噬菌体载体的构建2.λ噬菌体的改造切除非必需区段（重组基因簇）:1/3非必需区段切除必需的的RE识别位点，在非必需区引入合适的RE识别位点引入适当的选择标记基因以便重组子的筛选建立重组λDNA分子的体外包装系统，通过无意义突变将其改造成安全载体，以利于生物学防护。1)除去多余的限制酶识别位点–天然的λ-DNA上有多个酶切位点，如：EcoRI5个，HindIII7个，这些多余的酶切位点必须被修饰。–一般利用自然选择法获得限制性位点缺失的λ品系。–自然选择法可以利用一个产生EcoRI的大肠杆菌，大部分侵入细胞的λDNA分子会被限制性酶破坏，少部分能够成活，这些就是突变型的噬菌体，其EcoRI位点缺失了。2.λ噬菌体的改造通过自然选择法筛选无EcoRI识别位点的λ-噬菌体2)切除掉λDNA的非必需区–载体经改造后的长度约为40kb，但在非必需区域内含有两个相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或salI），两者间的距离为14kb长，使用时用酶切开，分离去除这个14kb长的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。–40-14kb=26kb包装下限为36.4kb，因此其载装下限为10.4而上限为25.5kb。–不再需要标记基因，因为空载的载体DNA只有26kb，不可能被包装，因而无法进入受体细胞中去2.λ噬菌体的改造3)引入无义突变–琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。–将野生型λDNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种λDNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。2.λ噬菌体的改造3.常用的λ噬菌体衍生载体载体名称分子大小(kb)可克隆外源DNA片段大小(kb)Charon3A4.830–21.4Charon4A4.540–20.1Charon174.640-22.4Charon2040.360–21.37Charon21A41.70–21.08Charon2839.390–20.05Charon3046.760-20.24LA7–140.60–24.1Sep6-lac544.30–22.4BF10146.06.3–24.4•插入型载体–只具有一个限制性核酸内切酶的酶切位点可供外源DNA插入的λ噬菌体派生载体–承载10Kb以内外源DNA片断•替换型载体(取代型载体)–具有两个限制性核酸内切酶的酶切位点，它们之间的DNA片断可被外源DNA片断取代–承载20Kb左右外源DNA片断•有多克隆位点，即可用作插入型又可用作取代型4.λ噬菌体载体的类型体外包装插入位点体外包装插入片段载体长度37kb插入片段大小：0-14kb（51–37）l-DNA载体的构建：缩短长度插入型载体43.34kbAJb527cI434EcoRⅠ43.7kbAJLacZ免疫功能失活插入型载体若CI插入外源基因溶菌透明噬斑若不插入外源基因溶源混浊斑β－半乳糖苷酶失活插入型载体若LacZ插入基因IPTG/X-gal平板有白斑若LacZ无插入基因IPTG/X-gal平板有蓝斑根据插入失活效应的特异性分为两种亚型：插入型载体的筛选λgt10λgt11不同的噬菌斑形态可作为筛选重组子的标记:imm434基因编码一种阻止λ-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活，l-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑体外包装体外包装插入片段最小装载长度10kb（51–26）载体长度26kb插入片段最大装载长度25kb（36–26）l-DNA载体的构建：缩短长度取代型载体替换型载体的筛选替换型载体的基因组中具有成对的限制酶位点，在这两个位点之间的DNA区段可以被插入的外源DNA片段所取代cos位点cos位点置换区域左臂右臂λNM781由于λ噬菌体的感染，寄主细胞lacZ基因的琥珀突变被抑制,所以能在乳糖麦康基氏(McConkey)琼脂培养基上产生红色的噬菌斑,或是在X-gal琼脂培养基上产生蓝色的噬菌斑。但如果具有supE基因的EcoRⅠ片段被外源DNA所取代，那么形成的重组体噬菌体在上述的两种指示培养基中都只能产生出无色的噬菌斑。应用指示性培养基可对这种重组体方便的筛选出来。宿主含lacZ的琥珀突变1.转染作用•转染：由宿主细胞捕获噬菌体或病毒DNA的过程。•转导：以噬菌体为媒介转移遗传物质的过程。•转化：质粒等外源DNA引入细胞的过程。2.λDNA的体外包装•是提高λ噬菌体转染效率的有效方法（三）λ噬菌体载体的应用包装有限制，λφDNA全长48kb，必需基因为28kb,包装外源基因限制全长105-75％（即51－28＝23kb;36－28＝8kb）包装限制范围为8-23kb，一般包装容量为15kb左右。λDNA的体外包装•凯伦噬菌体载体(Charon)•这类载体有插入型的，如Charon2；也有替换型的，如Charon30。在基因操作中用途很广。•Charon载体上具有适当数量的限制酶切位点，带有来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ（中央区段）。插入基因经包装后，可通过蓝/白斑筛选阳性克隆。•Charon载体的特点是容量大，对研究大范围内的染色体结构很有用处。它承受外源DNA的能力为几kb到23kb。当与外壳蛋白体外包装，形成噬菌体颗粒，其感染效率很高，几乎为100%，远高于质粒的转化率(0.1%)。（四）常用的λ噬菌体载体三、粘性质粒粘性质粒是带有λ噬菌体的Cos位点和整个pBR322的DNA序列的载体。粘性质粒（Cosmid）带有λ噬菌体的Cos位点和整个pBR322的DNA顺序。经感染进入细菌细胞以后，它就好象质粒那样在细胞中进行复制。易环化和扩增。分子量小，可包装30-45kb外源基因，可由Ampr抗性筛选，常用于构建基因文库。组成：质粒复制原点，抗药基因，多克隆位点，已连接入的λcos位点。1.粘性质粒的组成及性质2.粘性质粒的克隆无cos点，不包装DNA小于包装下线，不包装DigestionLigation（c）Packagingandinfect•λDNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25kb和1.5kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯质粒的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA的装载能力•考斯质粒是一类人工构建的含有λDNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体3.粘性质粒的特点•能像λDNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞•能像质粒那样在受体细胞中自主复制•重组操作简便，筛选容易•装载量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范围•不能体内包装，不裂解受体细胞4.粘性质粒作为载体的优点•M13单链DNA噬菌体为细线状DNA，呈单链环状，包装在线状蛋白外壳中。四、单链DNA噬菌体载体1.M13噬菌体的生物学特性2.M13噬菌体的基因组结构—9个基因，10种蛋白•基因Ⅰ、Ⅳ和Ⅶ编码特异性蛋白质，参与病毒颗粒的组装•基因Ⅱ参与DNA复制•基因Ⅲ、Ⅷ和Ⅸ编码M13的结构蛋白•基因Ⅴ参与单链复制过程中的环化作用•基因Ⅵ是衣壳蛋白的重要组成部分IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNA3.M13噬菌体感染、复制及包装•复制过程：–ss（+）RF(0-1min)(复制型DNA,replicativeDNA)–RFRF(0-20min)–RFss(+)(20min→∞)DNA包装无严格限制+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DNAIIV感染周期4.M13噬菌体载体的构建•M13-DNA上几乎没有非必需区域，因而载体的构建主要是插入标记基因如，lacZ、多克隆位点(polylinker)，消除多余的酶切位点。IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列载体lacZ‘polylinker•在M13上引入lacZ’基因，产生了M13mp1，这样就可以通过插入失活鉴定重组噬菌斑。M1