基因工程练习

专题１基因工程(一)1．基因工程的诞生。2．基因工程的原理及技术。3．DNA的粗提取与鉴定。课程标准考点一基因工程的基本工具一、与DNA分子相关的酶种类项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键作用结果形成黏性末端或平末端形成重组DNA分子形成新的DNA分子形成单链DNA分子二、载体1．作用(1)作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。(2)利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。2．具备的条件(1)能在宿主细胞内稳定保存并大量复制。(2)有多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。(3)具有某些遗传标记基因，以便进行筛选。3．种类(1)质粒：一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，能够自我复制的很小的双链环状DNA分子。(2)λ噬菌体的衍生物。(3)动植物病毒。【案例1】(2009·福建理综)转基因抗病香蕉的培育过程如图所示。质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ等四种限制酶切割位点。请回答：(1)构建含抗病基因的表达载体A时，应选用限制酶_____，对____________进行切割。(2)培养基中的卡那霉素会抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，欲利用该培养基筛选已导入抗病基因的香蕉细胞，应使基因表达载体A中含有____________，作为标记基因。PstⅠEcoRⅠ含抗病基因的DNA、质粒(3)香蕉组织细胞具有________，因此，可以利用组织培养技术将导入抗病基因的香蕉组织细胞培育成植株。图中①②依次表示组织培养过程中香蕉组织细胞的_________________。全能性脱分化、再分化【即时巩固1】(2010·江苏)下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：限制酶BamHⅠHindⅢEcoRⅠSmaⅠ识别序列及切割位点G↓GATCCCCTAG↑GA↓AGCTTTTCGA↑AG↓AATTCCTTAA↑GCCC↓GGGGGG↑CCC(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有________个游离的磷酸基团。(2)若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越________。(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是______________________________________。(4)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止______________。0、2高SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入________酶。(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了__________。(7)为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在______的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。DNA连接鉴别和筛选含有目的基因的细胞蔗糖为唯一含碳营养物质考点二基因工程基本操作程序分析一、目的基因的获取途径1．直接分离：从自然界已有的物种中分离，如从基因组文库中获取。2．人工合成目的基因常用的方法有：(1)已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。(2)以RNA为模板，在逆转录酶作用下人工合成。3．PCR技术与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理DNA双链复制(碱基互补配对)原料四种游离的脱氧核苷酸条件模板、ATP、酶等不同点解旋方式DNA在高温下变性解旋解旋酶催化场所体外复制主要在细胞核内酶热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)细胞内含有的DNA聚合酶结果在短时间内形成大量的DNA片段形成整个DNA分子二、基因表达载体的构建1．基因表达载体的组成：启动子、目的基因、终止子以及标记基因等。2．基因表达载体的构建方法三、将目的基因导入受体细胞生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术Ca2＋处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子四、目的基因的检测与鉴定1．分子水平检测(1)导入检测：DNA分子杂交技术，即使用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段作探针检测。2．个体生物学水平鉴定：对转基因生物进行抗虫或抗病的接种实验。【案例2】(2008·海南)如图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。据图回答：(1)将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切,酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有______、______、______三种。若要从这些连接物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行______。目的基因—载体连接物载体—载体连接物目的基因—目的基因连接物分离纯化(2)用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是________；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是________________________________。(3)目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是____，其合成的产物是________。(4)在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是________。目的基因—载体连接物、载体—载体连接物载体—载体连接物mRNA启动子EcoRI和BamHI(【即时巩固2】(2008·广东)天然酿酒酵母菌通常缺乏分解淀粉的酶类,用作发酵原料的淀粉需经一系列复杂的转化过程才能被利用。研究者从某丝状真菌中获取淀粉酶基因并转入酿酒酵母菌，获得的酿酒酵母工程菌可直接利用淀粉产生酒精。请回答下列问题：(1)将淀粉酶基因切割下来所用的工具是___，用__将淀粉酶基因与载体拼接成新的DNA分子，下一步将该DNA分子___，以完成工程菌的构建。(2)若要鉴定淀粉酶基因是否插入酿酒酵母菌，可采用的检测方法是________；若要鉴定淀粉酶基因是否翻译成淀粉酶，限制性核酸内切酶导入酿酒酵母菌DNA连接酶DNA分子杂交可采用________检测；将该工程菌接种在含淀粉的固体平板培养基上，培养一定时间后，加入碘液，工程菌周围出现透明圈,请解释该现象发生的原因。______________________。(3)如何进一步鉴定不同的转基因工程菌菌株利用淀粉能力的大小？____________________________________。(4)微生物在基因工程领域中有哪些重要作用？______。抗原－抗体杂交培养基中淀粉被水解的区域，遇碘不再变蓝色，产生透明圈测定相同培养条件下不同工程菌菌株的淀粉酶活性或酒精产量①工具酶主要来自微生物；②最重要的目的基因供体库之一；③目的基因的载体之一；④作为受体细胞；⑤提供用于发酵的工程菌考点一基因工程的应用成果一、植物基因工程的成果1．抗虫转基因植物：主要抗虫基因有Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等。抗虫棉、抗虫番茄、抗虫烟草都已获得成功，既减少了杀虫剂的使用，又保护了环境。2．抗病毒转基因植物：主要抗病毒的病毒外壳基因、病毒的复制酶基因、抗真菌的几丁质酶基因和抗毒素合成基因。考点整合多种抗病毒植株已培育成功并开始进行田间实验、栽培。3．抗逆转基因植物：主要有抗盐碱、抗干旱的渗透压调节基因、耐寒的抗冻蛋白基因、抗除草剂基因等，减轻了不利环境条件对农业生产造成的影响。4．利用转基因改良植物品质：主要成果有培育赖氨酸含量较高的玉米、耐储存的番茄、花色变异的矮牵牛花等。二、动物基因工程的成果1．提高动物生长速度：导入外源生长激素基因、培育转基因绵羊和转基因鲤鱼。2．改善畜产品的品质：如导入肠乳糖酶基因，生产低乳糖乳汁。3．用转基因动物生产药物：利用乳腺反应器生产抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素等医药产品。4．用转基因动物作器官移植的供体：利用基因工程抑制抗原决定簇基因的表达或除去抗原决定基因，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。三、基因工程药物利用转基因工程菌生产出人类蛋白质药物。四、基因治疗项目类型外源基因类型及举例过程特点成果举例体外基因治疗腺苷酸脱氨酶基因①从病人体内获得某种细胞②细胞培养③体外完成基因转移④筛选并扩增培养⑤重新输入患者体内操作复杂，但成功率高治疗复合型免疫缺陷症体内基因治疗治疗遗传性囊性纤维化病的基因外源基因→载体携带体内相应组织细胞操作简单，成功率低治疗遗传性囊性纤维化病【案例1】(2009·江苏)苏云金杆菌(Bt)能产生具有杀虫能力的毒素蛋白。下图是转Bt毒素蛋白基因植物的培育过程示意图(ampr为抗氨苄青霉素基因)，据图回答下列问题。(1)将图中①的DNA用HindⅢ、BamHⅠ限制酶切后，反应管中有________种DNA片段。(2)图中②表示HindⅢ与BamHⅠ酶切、DNA连接酶连接的过程，此过程可获得________种重组质粒；如果换用BstⅠ与BamHⅠ酶切，目的基因与质粒连接后可获得________种重组质粒。(3)目的基因插入质粒后，不能影响质粒的________。(4)图中③的Ti质粒调控合成的vir蛋白，可以协助带有目的基因的TDNA导入植物细胞，并防止植物细胞中________对TDNA的降解。421复制DNA水解酶(5)已知转基因植物中毒素蛋白只结合某些昆虫肠上皮细胞表面的特异性受体，使细胞膜穿孔，肠细胞裂解，昆虫死亡。而该毒素蛋白对人类的风险相对较小，原因是人类肠上皮细胞_______________。(6)生产上常将上述转基因作物与非转基因作物混合播种，其目的是降低害虫种群中的______基因频率的增长速率。表面无相应的特异性受体抗性【即时巩固1】(2008·山东理综)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育了耐盐水稻新品系。(1)获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的________处，DNA连接酶作用于________处。(填“a”或“b”)(2)将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和________。(3)由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用_____技术，该技术的核心是________和________。aa基因枪法植物组织培养脱分化再分化(4)为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的________作探针进行分子杂交检测，又要用______方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。一定浓度盐水浇灌耐盐基因考点二蛋白质工程与基因工程的比较项目区别与联系蛋白质工程基因工程区别过程预期蛋白质功能―→设计预期的蛋白质结构―→推测应有的氨基酸序列―→找到相对应的脱氧核苷酸序列获取目的基因―→构建基因表达载体―→将目的基因导入受体细胞―→目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品结果可生产自然界没有的蛋白质只能生产自然界已有的蛋白质联系(1)蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程(2)基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造【案例2】20