植物超氧阴离子自由基含量的测定

植物超氧阴离子自由基含量的测定一、实验目的学习测定植物组织中超氧阴离子自由基含量的方法二、实验原理进入生物体内的一些分子氧（O2），可经单电子还原转变为超氧阴离子自由基，特别是在逆境条件下这种单电子还原的几率更大。超氧阴离子即可直接作用于蛋白质和核酸等生物分子，也可衍生为羟自由基、单线态氧、过氧化氢及脂质过氧化物自由基等活性氧，引起对细胞结构和功能的破坏。因此测定逆境条件下植物组织中超氧阴离子自由基产生及清除速率，可间接了解组织细胞受损状况和抗性强弱。超氧阴离子自由基（O2−·）能与羟胺反应，生成NO2−，NO2−能与对氨基苯磺酸和а-萘胺反应生成粉红色的偶氮染料，该染料在530nm波长处具有显著光吸收。因此利用羟胺氧化的方法可以测定植物组织中超氧阴离子自由基（O2−·）的含量。三、器材与试剂1．实验仪器与用具研钵、高速冷冻离心机、微量移液枪、离心管、试管、水浴锅、容量瓶（10mL）、分光光度计2．实验试剂65mmol/L磷酸钾缓冲液（pH7.8）；提取缓冲液；10mmol/L盐酸羟胺溶液；58mmol/L对氨基苯磺酸溶液；7mmol/Lа-萘胺溶液；50μmol/LKNO2标准溶液3．实验材料小白菜、小麦四、实验步骤1.制作标准曲线取7支试管，编号，按表1分别加入各种试剂，摇匀。置25℃保温箱20min。分别加入1mL58mmol/L对氨基苯磺酸溶液和1mL7mmol/Lа-萘胺溶液，混匀。25℃保温20min，以0号管为对照进行调零，立即在波长530nm处测定吸光度。以吸光度值为纵坐标，NO2−物质的量（5μmol）为横坐标，制作标准曲线。表1标准曲线试剂表试管号1234567NO2−标准液（5μg/ml）00.20.40.81.21.62.0蒸馏水2.01.81.61.20.80.40对氨基苯磺酸———2.0———а-萘胺———2.0———2.提取取逆境处理的小白菜或者小麦叶片，正常条件下生活的叶片作为对照，剪碎混匀，分别称取1g样品，加入3ml提取缓冲液，在冰浴条件下研磨匀浆，于8000r、4℃离心10min，收集上清液，此液为植物O2−提取液。3.测定取2.0ml上清液，加入0.5ml50mmol/L磷酸钾缓冲液（pH7.8）和0.1ml10mmol/L盐酸羟胺溶液，摇匀，25℃保温20min。取出加入1ml58mmol/L对氨基苯磺酸溶液和1ml7mmol/Lа-萘胺溶液，混匀，30℃保温30min，加入等体积三氯甲烷萃取色素，10000r/min离心3min，取上层粉红色水相，测定530nm吸光度。表2NO2−产生O2−提取液（ml）2.0PBS（ml）1.5盐酸羟胺（ml）0.525℃保温20min表3NO2−产生显色（同标准曲线）上诉反应液（ml）2.0对氨基苯磺酸（ml）2.0а-萘胺（ml）2.030℃恒温箱中保温30min五、实验数据处理及分析根据样品管显色液与对照管显色液吸光值的差值，从标准曲线上查出相应的NO2−的浓度，并换算成超氧阴离子（O2−·）物质的量的浓度，从而计算出O2−的含量。O2−含量(μg/g)=2x·Vt·n/（Fw·Vs）式中，n为羟胺氧化反应产生的NO2−（μmol）；Vt为酶提取液总体积（mL）；Vs为羟胺氧化反应加入的粗酶提取液体积（mL）；Fw为样品鲜重（g）。试管1234567吸光度00.0960.2130.4450.6180.8050.970样品白菜（空白）白菜麦子（空白）麦子鲜重1.178g1.016g吸光度0.1870.5230.0890.199由回归方程y=0.4906x+0.0151可得白菜中NO2−的浓度（5μg/ml）为0.654，小麦中NO2−的浓度（5μg/ml）为0.193。白菜中O2−的含量（μg/g）=2x·Vt·n/（Fw·Vs）=2×10×0.654/(1.178×2×5)=1.111白菜中O2−的含量（μg/g）=2x·Vt·n/（Fw·Vs）=2×10×0.193/(1.016×2×5)=0.380780725六、讨论为什么O-2主要分布在小白菜的维管束中？通过观察可以发现，O-2主要分布在小白菜的叶柄和叶脉,即维管束中。植物在代谢过程中会产生许多活性氧自由基，线粒体是需氧生物细胞内产生O-2最多的地方。在整个电子传递链上传递大量电子时，已经有实验证实有些电子被漏出来，使氧气发生了电子还原而产生超氧阴离子自由基。维管束是指维管植物的维管组织，由木质部和韧皮部成束状排列形成的结构。维管束彼此交织连接，构成初生植物体输导水分，无机盐及有机物质的一种输导系统。O-2产生的途径有很多，适宜浓度的O-2在体内有重要意义，参与吞噬细胞杀灭有害的微生物，协助清除衰老、褪变的细胞，消灭突变的细胞等。所以作为主要运输途径的维管束，O-2在其中的含量必然会很高。七、实验注意事项1、分光光度计应放在干燥的房间内，使用时放置在坚固平稳的工作台上，室内照明不宜太强。要先预热10min，用0试管中的样品进行调零，比色杯的外壁要擦干净。2、取待测样品研磨定容时，可对其质量及容积等体积放大，最好用纱布过滤，这样能保证上清液的澄清度。3、离心机在预冷状态时，离心机盖必须关闭。使用时注意先配平。4、介质尽量减少Fe和O2的存在，α-萘胺不能用β-萘胺代替。5、显色反应后也可用等体积的正丁醇萃取（混匀、静置分层或离心）红色偶氮物质，然后测定正丁醇相的A530.6、用移液管移试剂时应该选用不同刻度的移液管，避免产生误差。