基因工程载体

5基因工程载体本章教学目的和要求：掌握载体的概念，载体具备的条件，构建质粒克隆载体的基本策略和过程；熟悉重要克隆载体的结构，特殊用途的载体；了解基因打靶载体，人工染色体克隆载体。重点：载体具备的条件，构建质粒克隆载体的基本策略和过程。基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实现。载体概念：在基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。CharacteristicsofvectorsforgenecloningMCSMarkerForeigngene基因工程克隆载体，必须具备以下条件：⑴复制子replicon⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。⑶具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。⑷自身分子量较小，拷贝数高。⑸在宿主细胞内稳定性高。5.1质粒载体（plasimidvectors）（一）质粒载体的生物学特性（二）质粒载体的制备（三）质粒载体的改造（一）质粒的生物学特性（1）质粒：独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状(少数为线形和RNA）DNA分子。广泛从在于细菌细胞中，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。大肠杆菌的质粒主要有F质粒（F因子）、R质粒（抗药性因子）和Col质粒（大肠杆菌素因子）三种。（一）质粒的生物学特性（2）质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种（3）赋予宿主细胞性状-抗性基因物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱抗菌素名称抗菌素作用方式宿主菌抗性机理氨苄青霉素（Amp）干扰细菌细胞壁合成编码-内酰胺酶,切割Amp-内酰胺环氯霉素（Cml）抑菌剂,与50S结合,干扰编码乙酰转移酶,使氯霉素蛋白质合成乙酰化失活卡那霉素（Kan）杀菌剂,与70S结合,mRNA编码氨基糖苷磷酸转移酶,发生错读修饰Kan失活链霉素（Sm）杀菌剂,与30S结合,mRNA编码特异修饰酶发生错读四环素（Tet）抑菌剂,与30S结合，阻止编码特异蛋白,修饰细菌膜蛋白合成结构,阻止Tet通过细胞膜（一）质粒的生物学特性（4）质粒的大小差异很大，最小的只有1kb,只能编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到200kb。（5）质粒的生存在寄主细胞中“友好地借居”，离开了寄主它本身无法复制；同时质粒往往有宿主专一性，如大肠杆菌的复制起点不一定能在其它生物细胞中繁殖。（一）质粒的生物学特性（6）质粒的复制类型一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。“严紧型”质粒（stigentplasmid）：拷贝数为1-3；“松弛型”质粒（relaxedplasmid）：拷贝数为10-60。（7）质粒的不相容性没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的质粒，不能够长期稳定的共存于同一宿主细胞中。（一）质粒的生物学特性（8）质粒的转移接合型质粒分子量大严紧型复制非接合型质粒分子量小松弛型复制是否含有接合转移基因非转移性质粒，不含tra基因；可以为转移性质粒所带动转移。转移性质粒，含有tra基因；能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞。在一般情况下，质粒的接合转移能力与分子大小及复制型间有一定的相关性。现归纳如下：（二）质粒DNA的制备碱裂解法煮沸裂解法（三）质粒载体的改造-策略⑴去掉非必需的DNA区段⑵减少限制性内切酶的酶切位点的数目⑶加入易于捡出的选择性标记基因氨苄青霉素抗性（Ampr）四环素抗性（Tetr)新霉素抗性（Neor）氯霉素乙酰转移酶（CAT）卡那霉素抗性（Kanr）⑷对质粒进行安全性改造，要求质粒不能随便转移。⑸改造或增加基因表达的调控序列。pBR322的构建1.质粒pBR322pBR3224363结构：（1）氨苄青霉素抗性基因（ampr或Apr）3种限制酶单一识别位点（2）四环素抗性基因（tetr或Tcr）内部有7种，启动区内有2种限制酶单一识别位点。（3）DNA复制起点（ori）pBR322质粒的优点：（1）具有较小的分子量4363bp，2.6×106Da，（2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。（3）具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后,每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。（4）对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割的位点。pBR3224363外源DNApBR3224363PstI酶切PstI酶切黏性末端黏性末端连接酶重组子(ampstetr)空载体(amprtetr)插入子(ampstets)野生型的E.coli(ampstets)导入涂布在含Tc的平板上重组子转化子(ampstetr)空载体转化子(amprtetr)影印在含Ap的平板上空载体转化子(amprtetr)因插入外源DNA而导致基因失活的现象称之为插入失活效应。对比两个平板上的菌落，凡在Tc平板上生长而在Ap平板上不能生长的菌落则是重组质粒转化子克隆，挑选阳性克隆，分离出重组质粒。（1）四环素：（2）氨苄青霉素抗性基因pBR322抗菌素标记选择产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。（3）环丝氨酸如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。（1）四环素抗性插入失活无环丝氨酸培养基（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。2.pUC质粒载体1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技术在pBR322基础上构建的。结构：（1）来自于pBR322的Ori（2）氨苄青霉素的抗性基因(Ampr)。（3）LacZ′基因编码β—半乳糖酶的α—肽链即氨基末端。（4）MCS区段是一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整个载体中是唯一的。pUC18/19：与pBR322相比，pUC质粒载体优点：（1）具有更小的分子量和更高的拷贝数如pUC8为2750bp，pUCl8为2686bp，控制质粒复制rop基因的缺失，平均每个细胞即可达500～700个拷贝（2）适用于组织化学法检测重组体通过-互补作用，利用菌落颜色筛选重组子。（3）具有多克隆位点区段（MCS）可以定向克隆防止载体自我连接。-互补(alpha-complementation)大肠杆菌-半乳糖苷酶可以和其底物X-Gal相互作用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的-片段和-片段分开时就失去了这种显色的功能。通常将编码该酶-片段的LacZ’基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序列中，而在一些人工构建的大肠杆菌株系中却只能编码产生该酶的片段。这样一来，含有功能性完整的LacZ’基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码的-片段就能和寄主编码的片段发生互补并具有了对底物X-gal的作用功能（发生显色反应），这种现象被成为是alpha-complementation.X-Gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷释放出的蓝色物质可以将整个菌落染成蓝色，非常容易辨别，如果LacZ’插入外源基因被破坏，菌落则是无色的,这种筛选称为蓝白斑筛选。组织化学法检测重组体X-Gal-半乳糖苷酶IPTG诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷半乳糖5-溴-4-氯-靛蓝＋a-互补显色反应（蓝白斑筛选）lacZ-β-半乳糖苷酶-分解乳糖iPO调控蛋白Pα-肽段分解X-gal产物呈现蓝色诱导剂IPTGβ-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15重要的大肠杆菌质粒载体pUC18/19：正选择标记lacZ’的显色原理pUC18/19PlaclacZ’MCS-半乳糖苷酶的-肽段OHHHOHHOHHOHCH2OHONClBrClBrClBrONN5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷X-gal蓝白斑筛选：利用β-半乳糖苷酶插入失活的载体，在生色底物(X-gal)和诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）存在时，可形成深蓝色菌斑。用这种载体进行克隆时，β-半乳糖苷酶基因的被外源DNA片段插入，所产生的重组体丧失α-互补能力，在含有X-gal和IPTG的平板下形成无色菌斑。因此，对于这类重组载体，可通过组织化学方法进行重组子的筛选。蓝斑白斑-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。3.pGEM-3Z多拷贝装有两个噬菌体的强启动子用于外源基因的高效表达装有多克隆位点（MCS）选择标记基因AprlacZ’注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3EPSP65.2l噬菌体载体噬菌体(bacteriophage,phage)：是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。根据噬菌体与宿主菌的相互关系，噬菌体可分为两类——毒性噬菌体/烈性噬菌体(virulentphage)：能在宿主细胞内复制增殖，产生许多子代噬菌体，并最终裂解细菌。温和噬菌体(temperatephage)：噬菌体基因与宿主染色体整合，不产生子代噬菌体，但噬菌体DNA能随细菌DNA复制，并随细菌的分裂而传代。温和噬菌体的基因组能与宿主菌基因组整合，并随细菌分裂传至子代细菌的基因组中，不引起细菌裂解。整合在细菌基因组中的噬菌体基因组称为前噬菌体(prophage)，带有前噬菌体基因组的细菌称为溶原性细菌(lysogenicbacterium).噬菌体侵染大肠杆菌毒性噬菌体的复制周期—溶菌性周期在液体培养基中，噬菌现象可使浑浊菌液变得澄清。在固体培养基上，若用适量的噬菌体和宿主菌液混合后接种培养，培养基表面可有透亮的溶菌空斑出现。一个空斑系由一个噬菌体复制增殖并裂解细菌后形成，称为噬菌斑(plaque),不同噬菌体噬斑的形态与大小不尽相同。噬菌斑5.2.1l噬菌体克隆载体噬菌体的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增大肠杆菌的l噬菌体DNA噬菌体的生物学特性：生物结构l噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体l噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成l-DNA全长48502个核苷酸l-DNA上至少有61个基因l噬菌体生物学特性：生物结构5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因l-DNAcos区：在l噬菌体线性双链DNA的左右两端，各有一个由12nt组成的彼此完全互补的5‘单链突出单链序列（黏性末端），分别为5’–TCCAGCGGCGGGG-3‘，3’-CCCGCCGCTGGA-5’，包装蛋白的识别位点。大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：缩短长度野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：插入型载体：只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点置换型载体：具有成对的克隆位点大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：插入型载体体外包装插入位点体外包装插入片段lgt载体长度43340