基因检测在疾病诊断和监测中的作用

第十一章分子生物学技术的临床应用上海交通大学樊绮诗四川大学范红•1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型•1990年人类基因组计划正式启动•2001年2月科学家宣布完成人类基因组的全部序列图第十一章分子生物学技术的临床应用•分子诊断不仅能早期对疾病作出确切的诊断，也能确定个体对疾病的易感性，判别致病基因携带者并对疾病的分期、分型、疗效监测和预后作出判断•分子诊断已成为实验诊断学的一个重要组成部分第十一章分子生物学技术的临床应用第十一章分子生物学技术的临床应用第一节标本来源第二节分子生物学技术在病原生物基因组相关疾病研究和诊断中的应用第三节分子生物学检验技术在疾病研究和诊断中的应用第一节标本来源•DNA或RNA来自外周血、体液、分泌物和组织如毛发、皮肤、肌肉、器官、肿瘤组织等•产前基因诊断标本：羊水细胞（16周～20周）绒毛膜细胞（7周～9周）第一节标本来源第二节分子生物学技术在病原生物基因组相关疾病研究和诊断中的应用第二节分子生物学技术在病原生物基因组相关疾病研究和诊断中的应用一、感染性疾病的诊断和治疗监测二、耐药监测与分子流行病学调查三、医院获得性感染的监测与控制一、感染性疾病的诊断和治疗监测•分子生物学检验技术在感染性疾病中的应用主要包括对病原生物进行鉴定、分型、耐药诊断和治疗过程中的疗效监测等•检测核酸分子或蛋白质分子•目前已经应用于一些重要的感染性疾病，如结核病、病毒性肝炎、艾滋病、SARS、人禽流感等一、感染性疾病的诊断和治疗监测（一）结核分枝杆菌（二）乙型肝炎病毒（三）人类免疫缺陷病毒（四）SARS冠状病毒（五）人禽流感病毒一、感染性疾病的诊断和治疗监测（一）结核分枝杆菌1.生物学特性与致病性2.基因组特点3.结核分枝杆菌核酸的检测（一）结核分枝杆菌1.生物学特性与致病性结核分枝杆菌复合群包括人结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌，其中前三者对人类致病人型结核分枝杆菌感染的发病率最高一、感染性疾病的诊断和治疗监测一、感染性疾病的诊断和治疗监测•结核分枝杆菌生长缓慢，增殖一代需15～20小时，生长成可见菌落一般需4～6周•在组织细胞内大量繁殖引起炎症，菌体成分和代谢物质的毒性以及菌体成分诱发的机体免疫损伤一、感染性疾病的诊断和治疗监测2.基因组特点共价封闭环状结构标准株结核分枝杆菌基因组全长4.4kb,包含4000个蛋白质编码基因和50个RNA编码基因一、感染性疾病的诊断和治疗监测(1)重复序列：如IS6110，仅存于结核分枝杆菌复合群细菌染色体上长1355bp的重复插入序列，具有复合群特异性(2)蛋白质编码基因(3)rRNA基因：每个细胞约含有103～104个rRNA，含有结核分枝杆菌高度保守的序列，也有分枝杆菌种特异性序列一、感染性疾病的诊断和治疗监测3.结核分枝杆菌核酸的检测•实验室检查手段主要包括标本直接涂片染色镜检、分离培养鉴定以及血清学抗原检测方法•分子生物学理论和技术已经用于分枝杆菌的分子结构和功能的研究中，并开始用于临床菌种和耐药株的鉴定及监测一、感染性疾病的诊断和治疗监测•PCR菌种鉴定法•PCR直接测序鉴定法•PCR-DNA探针鉴定法•PCR-基因芯片法(1)结核分枝杆菌菌种鉴定：一、感染性疾病的诊断和治疗监测(2)药物敏感性试验与耐药基因检测：缩短培养和鉴定的时间，及时指导临床选药•药物敏感性试验•直接检测耐药基因一、感染性疾病的诊断和治疗监测（二）乙型肝炎病毒1.生物学特性及致病性2.乙型肝炎病毒核酸的检测3.变异株与耐药突变检测1.生物学特性及致病性•HBV对外界环境的抵抗力较强，且传染性较强•输血或注射是重要的传播途径•HBV感染后潜伏期约2～6个月，HBVDNA在肝细胞内以游离DNA和整合到宿主细胞染色体的方式存在•HBV分为8个基因型，A～H型一、感染性疾病的诊断和治疗监测2.乙型肝炎病毒核酸的检测（1）荧光定量PCR技术：测定HBV病毒载量HBVDNA107拷贝/毫升，提示病毒复制活跃HBVDNA103拷贝/毫升、HBeAg转为阴性，ALT正常的病人预后相对较好一、感染性疾病的诊断和治疗监测（2）支链DNA（bDNA）技术：一种核酸探针杂交标志信号放大技术。优点：稳定性和重复性较好，结果准确，操作简单，将待测病毒裂解释放核酸后变性为单链，即可进行检测。缺点：敏感性较低、检测范围窄而不适用于低水平病毒的检测。一、感染性疾病的诊断和治疗监测3.变异株与耐药突变检测•HBV可能发生自然变异•HBV在人体活疫苗接种和抗病毒治疗等压力下发生变异•HBV基因组的变异常引起病毒生物学特性的改变，从而导致HBV感染发病机制的变化、血清学检测指标的改变以及免疫逃逸，给乙型肝炎的诊断和治疗带来困难一、感染性疾病的诊断和治疗监测HBV耐药突变类型及其核苷酸、氨基酸变化一、感染性疾病的诊断和治疗监测（三）人类免疫缺陷病毒1.形态结构与致病性2.HIV核酸检测1.形态结构与致病性•HIV根据血清学反应和病毒核酸序列分为HIV-1型、HIV-2型•HIV结构分为包膜、核心一、感染性疾病的诊断和治疗监测•HIV直接或间接损伤CD4+T细胞•HIV抑制抗原递呈细胞功能•HIV诱发自身免疫性疾病及诱导细胞凋亡•HIV导致CD8+T细胞丧失抗病毒活性等一、感染性疾病的诊断和治疗监测HIV感染以侵犯CD4+T细胞为主•原位杂交•PCR•NASBA技术•bDNA技术•荧光定量RT-PCR技术一、感染性疾病的诊断和治疗监测2.HIV核酸的检测的分子生物学方法（四）SARS冠状病毒从SARS病人体内分离到的冠状病毒与任何以往确定特征的冠状病毒关系不密切，且该病毒的有限区域的复制酶（rep）基因序列与其它冠状病毒明显不同，因而被称为SARS相关冠状病毒。一、感染性疾病的诊断和治疗监测SARS相关冠状病毒的检测WHO推荐SARS-CoV特异性检测方法：分子生物学检测免疫学检测细胞分离培养一、感染性疾病的诊断和治疗监测一、感染性疾病的诊断和治疗监测•免疫学方法难以在感染的窗口期对病毒感染进行早期检测•细胞培养所需时间较长，分离阳性率不高•PCR方法可以确诊早期疑似病人，但PCR试验阴性并不能说明没有SARS-CoV感染（五）人禽流感病毒人禽流行性感冒（简称人禽流感）是由禽甲型流感病毒某些亚型的毒株引起的急性呼吸道传染病，感染者大多因多脏器功能衰竭而死亡。一、感染性疾病的诊断和治疗监测（五）人禽流感病毒一、感染性疾病的诊断和治疗监测1.病原学特征及致病性2.人禽流感病毒的检测一、感染性疾病的诊断和治疗监测1.病原学特征及致病性•禽流感病毒属甲型流感病毒，基因组为单股负链RNA•依外膜血凝素（H）和神经氨酸酶（N）蛋白抗原性的不同，可分为15个H亚型和9个N亚型•感染人的禽流感病毒亚型主要为H5N1、H9N2、H7N7，其中感染H5N1的患者病情最重一、感染性疾病的诊断和治疗监测2.人禽流感病毒的检测(1)病毒核酸检测：RT-PCR技术从病人呼吸道标本中检测禽流感病毒亚型特异性H抗原基因。(2)病毒抗原蛋白质分子检测：取病人呼吸道标本采用免疫荧光法检测甲型流感病毒核蛋白抗原及禽流感病毒H亚型抗原。二、耐药监测与分子流行病学调查（一）耐药突变检测（二）分子流行病学调查二、耐药监测与分子流行病学调查•PCR-RFLP•SSCP•DGGE•PCR-反向斑点杂交技术•DNA序列分析•芯片技术等（一）耐药突变检测二、耐药监测与分子流行病学调查•追踪和控制传染源及可能的传播途径•确定同一病人反复感染是源于复发或再感染•明确某一菌株是否与某些临床表现相关，从而发现其特殊的传播和致病机制（二）分子流行病学调查二、耐药监测与分子流行病学调查1.IS6110RFLP2.间隔区寡核苷酸探针分型技术二、耐药监测与分子流行病学调查1.IS6110RFLPIS6110重复序列探针被称为结核分枝杆菌复合群分型的金标准。检测步骤：细菌培养提取基因组DNAPvuⅡ限制性酶水解Southern印迹IS6110探针杂交二、耐药监测与分子流行病学调查2.间隔区寡核苷酸探针分型技术•直接重复序列只在结核分枝杆菌复合群细菌染色体的某一位置出现，由多个高度保守的36bp的序列组成，其间被高度保守的34～41bp非重复的短序列间隔开•36bp重复序列出现的次数和某些间隔序列的出现或消失在不同菌株表现出可变性三、医院获得性感染的监测与控制•医院感染，又称院内感染，是指病人入院时尚未感染，也不处于感染的潜伏期，而是在入院以后（通常指入院48小时后）引起的感染，以及在医院内获得但在出院后才发生的感染第三节分子生物学检验技术在疾病研究和诊断中的应用第三节分子生物学检验技术在疾病研究和诊断中的应用一、单基因遗传性疾病的基因诊断三、多基因病的分子诊断四、在线粒体遗传病中的应用五、在白血病中的应用六、分子生物学在HLA配型中的应用二、单基因病的分子诊断一、单基因遗传性疾病的基因诊断（一）单基因疾病中常见的分子异常（二）遗传性疾病基因诊断的策略（三）基因诊断所采用的技术（四）遗传标志的选择（五）间接诊断的局限（一）单基因疾病中常见的分子异常•由于一个（或数个）基因发生异常导致这些基因所载有的遗传信息改变•基因突变主要包括三大类：点突变、片段性突变和动态性突变一、单基因遗传性疾病的基因诊断一、单基因遗传性疾病的基因诊断1.点突变2.片段性突变3.动态性突变1.点突变•点突变：DNA分子中单个碱基的替换•终止密码子突变：点突变导致提前产生终止密码，或终止密码突变而编码一个氨基酸使肽链延长一、单基因遗传性疾病的基因诊断一、单基因遗传性疾病的基因诊断•各种点突变所造成的后果：蛋白质分子量改变蛋白质合成量下降无蛋白质合成2.片段性突变核苷酸的丢失和增多缺失：基因中碱基（遗传物质）的丢失插入：外来基因片段插入某一基因序列中倍增：基因内部某一段序列发生重复一、单基因遗传性疾病的基因诊断3.动态性突变以三核苷酸为单位的重复序列，在传递过程中不稳定，会发生扩展，即子代的重复次数往往较亲代大为增加，因此又称动态性突变。脆性X综合征：CGG重复。少年脊髓型共济失调：GAA重复。……一、单基因遗传性疾病的基因诊断一、单基因遗传性疾病的基因诊断（二）遗传性疾病基因诊断的策略1.直接诊断策略2.间接诊断策略（二）遗传性疾病基因诊断的策略1.直接诊断策略基因诊断的直接策略就是通过各种分子生物学技术检测基因的遗传缺陷，因此直接诊断的前提是被检测基因的正常序列和结构必须被阐明。直接诊断是直接揭示遗传缺陷，因而比较可靠。一、单基因遗传性疾病的基因诊断2.间接诊断策略•间接诊断的实质是在家系中进行连锁分析，通过分析可确定个体是否存在双亲同源染色体中的致病染色体•间接诊断不是寻找DNA的遗传缺陷，而是通过分析DNA的遗传标志的多态性估计被检者患病的可能性一、单基因遗传性疾病的基因诊断•连锁分析(linkageanalysis):是通过用一系列覆盖密度适当的遗传标志在先证者家系中进行分析，从而找到与某一遗传标志紧密连锁的致病基因，并确定该基因在染色体上的位置一、单基因遗传性疾病的基因诊断（三）基因诊断所采用的技术一、单基因遗传性疾病的基因诊断2.基因表达异常的检测3.间接诊断所采用的技术1.直接诊断所采用的技术1.直接诊断所采用的技术•Southern印迹技术•多重PCR技术•PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）•等位基因特异性寡核苷酸（ASO）•DNA芯片技术（DNAchip）•单链构象多态性（SSCP）•变性梯度凝胶电泳（DGGE）•DNA序列分析（DNAsequencing）一、单基因遗传性疾病的基因诊断2.基因表达异常的检测定量PCR技术•DNA结合染料技术•水解探针技术技术•杂交探针技术一、单基因遗传性疾病的基因诊断3.间接诊断所采用的技术间接诊断就是分析DNA的遗传标志的多态性（1）限制性片段长度多态性（RFLP）第一代DNA的遗传标志，具双等位基因多态性，所含信息量有限。检测方法：Southern印迹技术、PCR-RFLP。一、单基因遗传性疾病的基因诊断