OECD测试准则--蚯蚓繁殖试验

经济合作与发展组织，简称经合组织(OECD)，是由30个市场经济国家组成的政府间国际经济组织，旨在共同应对全球化带来的经济、社会和政府治理等方面的挑战，并把握全球化带来的机遇。OrganizationforEconomicCooperationandDevelopment介绍•此测试准则的目的是评估土壤中的化学品对赤子爱胜蚓(Eiseniafetida，Savigny1826)或安德爱胜蚓(EiseniaAndrei，Andre1963)繁殖输出的影响。OECD以前发布过一个关于蚯蚓的急性毒性试验的准则。一些对蚯蚓的急性和慢性试验的其他的国际和国家准则已经发布。•赤子爱胜蚓（Eiseniafetida）/安德爱胜蚓（EiseniaAndrei）通常被认为是土壤动物群尤其是蚯蚓物种的一个代表。在相关资料中可以获得蚯蚓的生态背景资料和其在生态毒理学测试中的用途。试验原理使蚯蚓成虫接触一系列浓度的试验物质，这些试验物质可以是混合到土壤里，若为杀虫剂时，也可以应用到土壤或者土壤表面。应用方法视试验目的而定。选择的浓度范围中要包括在八周的时间内可能会引起亚致死和致死效应的浓度。在接触试验物质的4周后确定成虫死亡率和对蚯蚓成虫生长的影响。然后从土壤中取出成虫，再过四周后通过统计土壤中存在的子代数来评估对蚯蚓繁殖的影响。处理组的繁殖输出应当和对照相比较，以确定最大无影响浓度（NOEC，在毒性实验中某物质对受试生物无不利影响的最大浓度）和/或ECx(例如：EC10,EC50)。ECx值(例如：EC10,EC50)应当在试验选择的浓度范围内，使得ECx的测定来自插补法而不是外推法。试验物质信息•在水中的溶解度（watersolubility）•辛醇-水分配系数（logKow）•蒸气压（vapourpressure）•有效期和在环境中的特性（例如光解率和水解率，和应用方式相关）•本准则适用于不论其水溶性如何的所有物质。但该方法不适用于挥发性物质，此处定义为物质的亨利常数或空气/水分配系数大于1。也不适用于25℃下蒸汽压超过0.0133Pa的物质。•本准则没有考虑试验物质在试验期间发生降解的可能性。因此，不能认为在整个试验过程中所设浓度始终是初始浓度。在这种情况下，建议在试验开始和结束时都对物质进行化学分析。参考物质参考物质的NOEC和ECx值必须确定以保证足够的实验室试验条件和保证试验生物的响应不会随着时间发生统计学上的改变。建议一年测试参考物质一次，或者当试验进行频率比较低时，可以与试验物质的毒性一起测定。多菌灵和苯菌灵已被证明是对繁殖有影响的合适的参考物质。试验的有效性对照组应满足下列条件才能认为试验结果有效：•在试验结束时每个重复（包含10条成虫）应当产生≥30条幼虫；•繁殖的变异系数应当≤30%；•在试验开始四周后成虫死亡率应当≤10%。如果试验不能满足上述条件，那么试验应该终止，除非可以提供让试验继续下去的正当理由。该理由应当写进报告中。试验说明——设备应使用玻璃或其它化学惰性材料制成的约一两升容量的试验容器。该容器应具有约200cm²的横截面面积，使得500-600g干燥基质添加进去后潮湿基质在容器内能够达到5-6厘米的高度。容器盖的设计应允许底物和大气之间有气体交换，并且透光（例如通过一个穿孔的透明盖），同时还要防止蚯蚓爬出。如果试验加入基质的量超过500〜600g，那么容器中的蚯蚓数目也应该按比例增加。常规的实验室设备是必需的，具体如下：•干燥箱;•立体显微镜;•pH计和光度计;•合适的精确天平；•温度控制设备;•湿度控制设备（不是必需的，若容器有盖子）;•孵化器或带空调的小房间;•镊子，钩或环;•水浴锅。人工土壤的准备在试验中所用的人工土壤应当包含以下组分：•10％的泥炭（尽可能使pH值至5.5〜6.0，无肉眼可见的植物残株，磨细）；•20％的高岭土（高岭石含量最好在30％以上）；•0.3%至1.0％的碳酸钙（CaCO3，细粉状，分析级）。•70％风干的石英砂（取决于CaCO3的需要量），主要是含有超过50%的50-200μm之间颗粒的细砂。注：•所需的CaCO3量取决于土壤基质（包括食料）的成分，实验前应当通过测量土壤次级样本确定下来具体数值。•有时需要减少人工土壤中的有机碳含量，可以通过降低泥炭含量至4-5％或相应地增加砂粒含量。通过有机碳含量的减少，可以降低土壤中的有机碳对试验化学品的吸附并增加试验化学品接触蚯蚓的可能性。有证据表明在有机碳含量较低（如2.7%）的田间土壤试验时，赤子爱胜蚓遵守该繁殖有效准则，而且经验表明在有机碳含量5%的人工土壤中同样遵守该准则。在通风的地方把土壤中的这些干燥成分进行充分混合（例如用一个大型的实验室用混合机）。在开始试验前，向人工土壤中加入足够的去离子水，使其达到最大持水量的的40-60%。使得土壤基质放在手里压紧时不会有水分流出，且没有积水。人工土壤的最大持水量（WHC）的测定依照附件2或ISO11274（15）中描述的程序。•如果试验物质是直接应用于土壤表面或者不必加水就混合到土壤里，那么所需的水可以在制备土壤时加入。如果试验物质要先用部分水溶解，那么所需的额外的水可以和试验物质一起加入（见后文描述）。•在试验开始和结束时的土壤水分含量的测定应遵循ISO11465，土壤pH值的测定应按照附件3或ISO10390的描述来进行。对照组和每一个处理组都要测定。若测试物质为酸性或碱性时，那么不需要调整土壤的pH值。在整个试验过程中应通过定期称重容器来监测水分含量（见后文描述）。蚯蚓的选择和准备•试验中所用蚯蚓为赤子爱胜蚓和安德爱胜蚓。应选择具有环带的两个月至一年大小的成虫。同一个试验中所用的蚯蚓要来自同一生长环境，并且大小、虫龄尽量均匀一致（附件4）。虫龄差别最好不要超过四周。•选择好的蚯蚓在用于试验前要先在所用的人工土壤环境中适应至少一天的时间，在此期间应使用和在试验中一样的食物。•10条蚯蚓为一组，每一组单独称重。然后在试验开始前随机分配到各个培养容器中。称重前蚯蚓要先用去离子水清洗干净，然后放到滤纸上吸去多余水分。清洗好后的每一条蚯蚓的重量应在250-600mg之间。试验浓度的准备试验物质有两种应用方法：混到土壤里（见后文描述）或者撒到土壤表面（见后文）。根据试验目的选择应用方法。一般情况下，建议把试验物质和土壤混合。不过，应用方法有时需要和常规的农业实践一致（例如：液体制剂需要喷洒，或使用一些特殊的剂型如颗粒剂和拌种剂时）。溶剂在选择上要求对蚯蚓低毒，并且在试验设计中应当包含适当的溶剂控制。试验物质和土壤混合◆易溶于水的试验物质◆不溶于水的实验物质◆既不溶于水也不溶于有机溶剂的测试物质易溶于水的试验物质试验即将开始前，要准备足够量的试验物质的去离子水溶液，使其可以满足一个浓度的所有重复的使用量。可能需要一个有助于制备试验物质水溶液的共溶剂，可以很方便地制备要达到最终水分含量（40〜60％的最大持水量）所需溶液的量。将溶液和土壤完全混合均匀后，放入试验容器中。不溶于水的试验物质将试验物质溶解到少量的合适的有机溶剂（如：丙酮）中，然后喷洒到或混入少量的细石英砂中。然后放到通风橱中几分钟，使有机溶剂蒸发掉。然后把处理过的石英砂与预先湿润的人工土壤混合均匀。然后加入所需的去离子水量，以达到最终水分含量（40〜60％的最大持水量），并混合均匀。然后放到试验容器中。不过要注意有些有机溶剂可能对蚯蚓具有毒性。不溶于水也不溶于有机溶剂的试验物质用10g细磨的工业石英砂和所需的试验物质制成混合物。然后把该混合物混入到预先湿润的人工土壤中，再加入剩余的去离子水以达到最终含水量（40〜60％的最大持水量）。然后待用。试验物质应用到土壤表面•先加蚯蚓然后再处理土壤。容器中先放入湿润的土壤，然后在表面放入蚯蚓。通常健康的蚯蚓会立即钻入土中，所以，15分钟后还未钻入土中的蚯蚓则视为受伤，需要更换。更换后，那么更换的和被更换的蚯蚓都要称量体重，以确保开始时处理组蚯蚓的总体重及加上容器一起的重量均为已知。•处理组和对照组试验条件喂养浓度设计实验设计试验持续时间和结果评估极限测试处理组和对照组•建议每500-600g干人工土壤放10条蚯蚓，即每50-60g土1条蚯蚓。试验物质为拌种剂时，可能会使用更多的土，但是仍要保持每50-60g土有一条蚯蚓，可通过相应地增加蚯蚓数量来实现。每个处理组和对照组准备10条蚯蚓，蚯蚓要用水清洗干净并擦干水分，然后放到滤纸上一小段时间以吸去多余的水。•为了确保向容器中分的蚯蚓保持大小的均匀，应随机选择10条蚯蚓，并称重。加入蚯蚓后，称量每个容器重量，以便以后监测水分含量的变化。然后加盖。•对于上述提到的每个应用方法都要准备合适的对照。每个对照组除了不加试验物质外所有的程序都要相同。因此，根据需要，有机溶剂、石英砂等物质在浓度及用量上都要和处理组保持一致。试验条件•喂养•试验期间只要可以维持蚯蚓体重的食物均可以被接受。经验表明燕麦片、牛马粪是比较适合的食物。应当检查以确保粪源动物没有使用过生长促进剂、杀线虫剂等类似兽药，否则可能对蚯蚓造成不利影响。推荐自己收集牛粪，因为经验表明用作花园肥料的市售牛粪对蚯蚓生长有不利影响。牛粪在使用前应当风干，磨细并巴氏杀菌。•每一批新鲜的食物要先喂养不用来试验的蚯蚓，以确保食物质量可靠。和不食用新鲜食物的培养在人工土壤中的蚯蚓相比，生长速度和蚓茧产量不应减少。•在加入蚯蚓和试验物质后，第一次加食物。每容器放入5g食物，均匀撒到土壤表面，并用去离子水润湿（每容器5-6ml）。在以后的四周内每隔一周加一次食物。如果食物没被吃光，那么应当减少投喂量，避免真菌生长及发霉。在试验的28天后移去成虫蚯蚓，然后向每一容器内再添加5g食物。在剩余的四周内不需要再添加食物。浓度设计如果提前知道试验物质的毒性（例如可通过急性毒性试验或致死剂量测定实验获得），会有助于浓度的设计。必要时，可以先进行致死剂量测定实验，浓度设计为0.1，1，10，100，1000mg/kg干土。只需一个重复即可。两周后查死亡率。试验设计该准则旨在测定NOEC和ECx。参考线蚓的繁殖试验，设置浓度范围时，有三种设计方法。即以下：•测定NOEC时，应至少设成等比数列的5个浓度。建议每个浓度4重复，加8个对照。浓度间距不要超过2.•测定ECx（例如EC10，EC50等）时，设置浓度的数量应该满足能产生在统计学上有显著不同的4种结果。建议每个浓度至少两个重复，六个对照。浓度间距可以有变化，如果是在期望的浓度范围内，那么间距≤1.8，否则大于1.8。•第三种方法可同时用于ECx和NOEC的测定。设成几何级数的8个浓度。每个浓度4个重复，加8个对照。浓度间距≤1.8。试验持续时间和结果评估•在第28天观察并计数活着的成虫蚯蚓数。任何非正常的行为（如不再具备钻入土中的能力或躺着不动等）或形态上的变化（如伤口）要同时记录下来。然后移除所有成虫，并计数称重。把土壤倒到一个干净的托盘中可有助于挑出成虫。挑出的成虫要先用去离子水清洗，然后吸去多余水分再称重。在此时找不到的成虫可记录为死亡，因为通常认为在评估之前他们就已死亡并被分解。•土壤从容器中倒出并挑出成虫后，然后重新放回容器中（确保把蚓茧也放回容器）。然后在相同的条件下再培养4周（除了这四周内只在开始投放一次食物之外）。•试验结束后，计数子代数及蚓茧数。从土中用手直接挑蚯蚓计数很费时。那么怎样才能更有效地计数从蚓茧孵出的子代数量呢？推荐以下两种替代方法：（a）把容器放到初始温度为40℃的水浴中，然后升温到60℃。大约20min后，幼虫就会出现在土壤表面，从而可以很容易地挑出并计数。（b）试验土壤可以使用VanGestel等人的方法借助筛进行冲洗。如果加入到土壤中的泥炭和牛马粪或燕麦片都已被磨成细粉状。把网孔为0.5mm的两个筛子上下叠放在一起。然后把容器中的基质放到上层筛子中，用强自来水流进行冲洗，使得大部分的子代蚯蚓和蚓茧留在上层筛中。重要的一点是，在操作期间要注意保持上层筛整个表面的湿润，使得蚯蚓可以浮在其上的水膜上，从而防止蚯蚓从