DBI讲座--qPCR技术--细节决定成败

中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士DBIBioscience5年资深专家党希龙程涛细节决定成败QPCR的技术细节对实验结果的影响DBIBioscience主要做什么？我们有哪些优势产品？我们为中国的客户带来更好的..........FREE!!!DBIBioscience实验设计试剂使用仪器使用技术细节结果分析新的选择我们的生产地——路德维希港（德国）我们为您提供欧洲领先的QPCR试剂我们在网络存在：严谨、科学、质量可靠，技术先进、选材严格，良好的技术性和耐久性、不计成本节能、成本控制好，舒适性和使用便利性最大一些不容易被发现的零部件质量低，qPCRMix对比实验3种qPCRMix包括：SYBRGreen法：SYBRPremixExTaq(Tak公司)StormStarSybrGreenPCRMasterMix（DBI-2143）BeStarSybrGreenqPCRMasterMix（DBI-2043）第1部分模板：人源cDNA引物：IC1(forSYBRGreen)SYBRGreen:Mix10uLRox0.4uLTemplate4uLPrimerF(10uM)2uLPrimerR(10uM)2uLH2O1.6uL95℃5min95℃15s50℃45s40cycles10ng/well1ng/well0.1ng/well0.01ng/well1pg/well0.1pg/well0.01pg/well1fg/well使用7300荧光定量PCR仪进行检测Tak公司SYBRPremixExTaqStromStarRealtimePCRMasterMix（DBI-2143）BeStarSybrGreenqPCRMasterMix（DBI-2043）扩增曲线Tak公司SYBRPremixExTaqStromStarRealtimePCRMasterMix（DBI-2143）BesStarSybrGreenqPCRMasterMix（DBI-2043）模板浓度(/well)Ct值1fg35.1934.920.01pg31.5531.150.1pg27.6827.761pg23.7724.050.01ng20.7220.590.1ng17.1117.051ng13.4413.2110ng9.039.23模板浓度(/well)Ct值1fg/well34.0934.400.01pg/well31.0031.230.1pg/well27.5827.441pg/well23.7823.860.01ng/well20.3920.340.1ng/well16.8317.151ng/well13.4913.4610ng/well9.959.93模板浓度(/well)Ct值1fg/well33.2833.950.01pg/well29.1930.170.1pg/well26.5527.231pg/well23.2723.170.01ng/well19.6919.740.1ng/well16.4016.341ng/well12.6512.5510ng/well7.978.57总结11.将cDNA模板进行浓度梯度稀释(10ng/well-1fg/well)，分别加入3种SYBRGreenMix，使用IC1引物进行扩增，Ct值与模板浓度有较好的线性关系，其中:Tak公司SYBRPremixExTaq：R²=0.999StromStarRealtimePCRMasterMix：R²=0.999BeStarSybrGreenqPCRMasterMix：R²=0.998说明在模板浓度较低的情况下(1fg/well)，各Mix仍能使扩增反应保持特异性；2.3种SYBRGreenMix之间扩增效率没有明显区别；第2部分qPCRmix扩增miRNA的效果比较qPCRmixSYBRGreen法：SYBRPremixExTaq(Tak公司，批号A3701)SYBRPremixExTaq(Tak公司，批号A4504)StormStarRealtimePCRMasterMix（DBI-2143）BeStarSybrGreenqPCRMasterMix（DBI-2043）Mix10uLRox0.4uLTemplate(hsacDNA)5uL(1ng)PrimerF(10uM)2uLUPM(10uM)2uLH2O0.6uL95℃5min95℃15s50℃45sDissociationCurve40cyclesprimerTakara(A3701)Takara(A4504)DBIStormStarDBIBeStarmiR-18a-5p25.0624.9525.5624.98miR-18a-3p26.5526.6127.5125.88miR-139-5p22.9422.9223.4122.51miR-140-5p22.8022.9124.2222.97miR-142-5p22.1122.2023.3623.45miR-143-3P16.5916.6717.8817.12miR-144-3p23.7523.4623.3122.45miR-145-5p16.7816.9317.8616.95miR-146a-5p23.0923.1124.4122.98miR-142-3p20.7620.7820.4920.62miR-141-3p27.7730.9824.7722.26miR-141-5p30.3330.4829.3526.76miR-10a-3p27.9027.5325.6726.52miR-145-3p33.7732.9125.9424.662.1.Ct值比较•绿色标记：引物特异性较好(溶解曲线为单峰)•橙色标记：引物特异性较差(溶解曲线出现双峰等)miR-18a-5p2.2.扩增曲线及溶解曲线举例T-A3701T-A4504StormStarBesStar当引物特异性较好(溶解曲线为单峰)时，4种mix之间扩增效果没有明显区别，Ct值也较为接近；miR-141-5p2.3扩增曲线及溶解曲线举例T-A3701T-A4504StormStarBesStar当引物特异性不够时(溶解曲线出现双峰等)，4种mix扩增效果差异较大。miR-139-3p2.4扩增曲线及溶解曲线举例T-A3701T-A4504StormStarBesStarStormStarT-A3701T-A4504BesStar扩增miR-139-3p时，Tak公司(A3701)，Tak公司(A4504)及DBIBeStar扩增曲线也不正常，溶解曲线也均出现乱峰，仅DBIStormStar（DBI-2143）扩增曲线正常，溶解曲线为单峰。•当引物特异性较好(溶解曲线为单峰)时，4种mix之间扩增效果没有明显区别，Ct值也较为接近；•当引物特异性不够时(溶解曲线出现双峰等)，4种mix扩增效果差异较大，整体说来DBIStormStar和DBIBeStar比Tak公司(A3701)Tak公司(A4504)的Ct值更小；•Tak公司mix两个批次之间(A3701和A4504)没有明显差异；•DBIBeStar与两种Tak公司mix没有明显差异；•使用质量较差的引物时，DBIStormStar具有更高的特异性(相比另外3种mix)；小结2SYBRGreenmix检测批次：BesStarSybrGreenqPCRMasterMix-619（DBI-2043）BesStarSybrGreenqPCRMasterMix-621（DBI-2043）BesStarSybrGreenqPCRMasterMix-623（DBI-2043）SYBRGreenqPCRMasterMix（Tak公司，A4504）第3部分三批次DBISYBRmix与Takara的对比实验Mix10uLRox0.4uLTemplate(血浆cDNA)0.1uLPrimerF(10uM)2uLUPM(10uM)2uLH2O5.5uL95℃5min95℃15s60℃45sDissociationCurve40cycles3.1.Ct值比较•橙色标记：DBI三个批次的mix扩增Ct值明显小于Tak公司•其他无标记：DBI三个批次的mix之间与Takara之间均无明显差异primer/mixDBI-619DBI-621DBI-623TAKARAmiR-1新28.9328.4828.8626.5728.4328.4528.6128.7629.2633.7634.52miR-122-5p新22.9522.0422.8222.3822.8823.0923.0323.3224.0926.2025.39miR-146a-5p25.1424.9124.8922.4824.8425.0024.9325.1825.1825.4925.21miR-22-3p20.5520.6220.8220.6620.7420.7920.7620.7620.8221.1720.65miR-25-3p20.2520.2720.2820.2020.0320.1920.3120.2720.6120.5620.19miR-451a13.7213.9913.6313.4513.5113.5413.8813.7313.8714.2213.89miR-92a-3p18.7518.8818.8918.7719.1818.7418.9419.1119.2919.3718.93EC1新17.7217.6217.4817.4417.6617.8317.9218.2018.4817.7717.72miR-13.2.扩增曲线及溶解曲线举例当引物扩增Ct值较大（30左右，且引物特异性较差）时，DBI三个批次的扩增性能优于Tak公司mix。BesStarT-A4504BesStarT-A4504miR-22-3p3.3.扩增曲线及溶解曲线举例当引物扩增Ct值较小（正常扩增）时，DBI三批次的扩增性能等于Tak公司mix。但融解曲线相对更好。BesStarT-A4504BesStarT-A4504•当引物特异性较好(溶解曲线为单峰)时，4种mix之间扩增效果没有明显区别，Ct值也较为接近；•当引物特异性不够时(溶解曲线出现双峰等)，DBI三种mix扩增效果没有明显区别，但Ct值数据都小于Tak公司mix；•使用质量较差的引物时，选用DBImix可以得到更优的数据，但需补充阴性对照数据来进行判定；小结3使用DBIBioscience的qPCR(SYBRGREEN)最近发表的文章（影响因子20.22分）VEGFR-3inMacrophagesRestrainsTLR4-NF-κBSignalingandProtectsagainstEndotoxinShock张彦波May13,2014上海中科院生化细胞所内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法实验流程及注意事项荧光定量PCR解析方法实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测荧光定量PCR原理扩增曲线荧光阈值Ct值荧光定量PCR原理在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，在引物一模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环。多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。PCR产物的积累规律PCR产物的积累规律示意图荧光定量PCR定量原理扩增曲线荧光定量PCR定量原理为什么终点定量不准确呢？荧光定量