ELISA--原理、方法及操作细节

ELISA酶联免疫吸附试验主讲人：刘畅研究生导师：马学恩教授ELISA（酶联免疫吸附试验）Enzymeslinkedimmunosorbentassay简介1971年，瑞典学者Engvail和Perlmann、荷兰学者VanSchuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附试验。ELISA就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种新技术。该技术应用非常广泛，几乎所有的可溶性抗原-抗体系统均可用以检测。酶和抗体或抗原结合后，既不改变抗体与抗原免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性，即在相应而合适的作用底物参与下，使基质水解而呈色，或使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜和电子显微镜观察，也可用分光光度计加以测定。呈色反应显示了酶的存在，从而证明发生了相应的免疫反应。所以，这是一种特异而敏感的技术，可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克，甚至纳米水平上对其进行定量。基本原理先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法分离抗原-抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量。方法类型酶联免疫吸附试验的主要技术类型有双抗体夹心法、间接法、竞争法、捕获法等。1，双抗体夹心法：此法常用于检测抗原它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争性反应类型。抗体A待测抗原酶标抗体包被物2，间接法测定抗体此法常用于测定抗体将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。抗原待测抗体酶标二抗包被物3，竞争法此法既可用于检测抗原和半抗原，也可以用于检测抗体用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。限量的的抗体酶标抗原样品抗原酶标多于样品显色程度深样品多于酶标显色程度浅显色程度与待测物含量成反比包被物4，捕获法（反向间接法）主要用于测定血清中某种抗体亚成分以目前最常用的IgM测定为例，因血清中针对某种抗原的特异性IgM和IgG同时存在，而后者可干扰IgM的测定。因此，先针对IgM的第二抗体(如羊抗人IgMμ链抗体）连接于固相载体，用以“捕获”样品中所有IgM；洗涤除去IgG等无关物质，然后加入特异性抗原与待测IgM结合；再次加入抗原特异的酶标抗体；最后形成固相二抗-IgM-抗原-酶标抗体复合物，加酶底物显色后，即可对待IgM进行定性和定量测定。针对IgM的第二抗体待测物其中含有IgM和IgG特异性抗原与IgM结合酶标抗体包被物IgG等无关物质被洗脱具体步骤包被封闭加待测物加一抗，二抗，或抗原等显色包被用包被液稀释包被抗体至合适浓度，包被酶联板（聚乙烯微量反应板），每孔100μ。用保鲜膜包好，4℃过夜。如急用，包被2h后，清洗也可用，但最好过夜。次日弃去孔内溶液，并在面巾纸上拍干。用PBST洗液，洗4~5次。每次在洗板机清洗酶联板上震荡2~3min后，在面巾纸上拍干后进行下一次清洗或下一步。包被液0.05MPH9.6磷酸盐缓冲液Na2CO31.59g；NaHCO32.93g；加蒸馏水至1000mlPBST洗液2000mlPBS+1mlTween-20PBS：NaCl8g；KCl0.2g；Na2HPO41.42g；KH2PO40.27g；加1000ml蒸馏水定容，调PH至7.4洗板机封闭用封闭液封闭，每孔100μ。室温下，在微量振荡器上，封闭2h。弃去孔内溶液，并在面巾纸上拍干。用PBST洗液，洗4~5次。（同包被）用保鲜膜包好，4℃可保存一个月。封闭液10%小牛血清（1ml小牛血清加到9ml1×PBS中混匀）。5%脱脂奶粉（用洗液稀释）加标准样及样品待测样或标准一抗：用PBST洗液进行稀释到适合浓度，每孔100μl，包好保鲜膜。室温下，在微量振荡器上孵育2小时。清洗。二抗：用PBST洗液进行稀释到适合浓度，每孔100μl，包好保鲜膜。室温下，在微量振荡器上孵育1小时。清洗。注意抗体抗原反应比较快，一般1~2个小时就达到峰值。延长反应时间容易出现非特异结合，但反应时间不能少于1.5小时。二抗的使用浓度（一般，1：10000稀释）应当进行预实验确定，二抗的反应时间不能过长，容易出现非特异反应。一般，反应40~60分即可。OPD显色临用前取A液5.14ml，B液4.86ml加入OPD(邻苯二胺，在-20℃中保存）0.0040g（约4小片），溶解后加入50μl的30%H2O2，配成显色液。（OPD要充分混匀，否则容易出现个别孔颜色太深）显色液每孔100μl。避光显色15~20min。用2mol／LH2SO4终止反应，每孔50μl显色液A液：0.2mol／LNa2HPO4Na2HPO4·12H2O71.7g加水至1000mlB液：0.1mol／L柠檬酸柠檬酸19.2g柠檬酸，加水至1000ml结果判定酶标测定仪检测（429nm），测定OD值：待测孔（P）与对照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者为阳性注意：要有阴性，阳性对照。应用ELISA法由于测定灵敏、特异、操作简便、酶标记试剂比较稳定、易于自动化、无反射性污染，且易与其他相关技术偶联，使其成为目前应用最广泛而且发展最快的一种免疫测定技术。市场上符合质量要求的商品试剂盒（提供有包装好的固相载体、酶标记物及其底物和洗涤液等全套试剂成分）和自动或半自动检测仪不断研究发明问世，极大地促进了ELISA测定技术的普及。所有血清学试验要注意为了达到定量检测的目的，所用的检测试剂中必须至少有一个试剂是可检测的纯品必须有一种分离方法使得结合的标记物与没有结合、游离的成分分开，这样才能测定特异性结合的百分比。谢谢大家！