重组DNA生物制品生产用细胞质控生产工艺和制剂研究一般要求(罗建辉)

重组DNA生物制品生产用细胞质控生产工艺和制剂研究一般要求罗建辉2009年9月CDE药物研发与评价研讨班（生物制品药学研究一般要求）主要内容细胞质控研究生产工艺研究制剂处方研究小结2药学研究评价的几点共识3树立科学的研究/审评理念结合现有的技术手段/方法鼓励拥有自主知识产权的创新研究促进研究和评价的良性互动发展从总体水平上研究和评价确立的目标和内容从具体项目上进行充分的研究评价从统筹策略上缩小理想与现实的差距从实际过程中体现出阶段性和衔接性技术要求药学研究评价的几个关注点区分已上市或已有国家标准的研究评价（从严控制）和完全自主创新、未上市品种的研究评价（鼓励支持）区分首个品种研究开发（困难大、缺乏经验）与已有技术平台基础上扩展研究（成功经验、相对容易）区分临床试验阶段（不断完善提高）与产业化设概念车阶段研究评价（稳定成熟规范）区分完全依靠自主创新（孤立封闭）与基础雄厚、发挥互补优势开展协作研究的国内外差异（联合互助）4一、细胞质控研究5（一）相关文件国家局发国药监注[2003]109号文《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》2005年版《中国药典》中生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程；药审中心公布《治疗性重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制技术评价一般原则》6（一）基本内容细胞来源、培养历史；细胞检定，鉴别、病原引资检查、致瘤性试验、细胞核型；细胞的培养，培养基、添加成分、培养条件，特殊要求；细胞的建库，原始细胞、朱细胞、工作细胞三级库；细胞的传代和稳定性，生物、遗传稳定性7细胞来源、培养历史宿主细胞来源、背景应十分清楚采用适宜的宿主细胞，全新（未使用过）需谨慎选择，推荐有使用经验（临床/生产）的细胞；明确存在的内源性病毒和/或致瘤性等影响制品安全性的因素尽可能选择致瘤性试验阴性和/或低增值代次水平的宿主细胞8细胞检定确认建库的细胞符合预期设计要求携带有稳定的目的基因能够持续表达有功能活性的目的产物没有微生物污染和混杂其他细胞能够直接扩增储备或者应用于生产9细胞检定原始库细胞和/或主库细胞，通常需要进行一次全面系统的研究检定，包括遗传性、生物学和微生物学，以便从源头开始控制起始细胞的一致性和防止污染经过传代稳定性研究的主细胞到工作细胞，只经过简单的传代、扩增、可以适当简化检定项目，重点检查外源因子污染和防止混入了其他细胞保存数目和传代水平应保证生产用细胞的持续稳定供应10细胞检定（具体内容）11细胞鉴定，种属鉴定，致瘤性试验，目的基因和表达框架分析，表达产物检测微生物污染检查，细菌、真菌、支原体检查、病毒因子检查病毒因子检查，体外和体内试验、抗体产生试验、逆转录病毒（逆转录酶、感染试验），电镜检查建库、传代至少构建两级种子库初始工程细胞株应为经过克隆选择而形成的均一细胞群体必要时须经与实际生产过程采用的无血清培养基和培养条件相一致的适应性培养使每批产品都有一个经过鉴定的共同起源细胞保证生产的可持续性和产品质量的稳定重组制品的生产必须建立在良好的细胞库管理基础上12稳定性研究是细胞始终能够持续、稳定地表达重组制品，并将对种产品产生安全性影响的风险因素严格控制在最低限度应包括库细胞、生产过程中细胞、生产终末期和/或超过生产终末期等不同培养时间的细胞；制定库细胞的限传代次和生产细胞的增殖限度以保证实际生产过程中细胞整体扩增水平及伴随的内源性病毒和/或致瘤性风险等的一致状态在预期限度范围内；13稳定性研究库细胞应重点考察储存、复苏等操作处理因素的影响和传代过程中的遗传稳定性，在此基础上确定库细胞传代限度生产过程中细胞、生产终末期和/或超过生产终末期细胞应考察模拟生产工艺和培养条件对细胞生长状况、表达能力等的影响，并确定生产细胞增殖限度和/或连续培养时间14稳定性研究复苏的库细胞连续传代培养至一定的代次工作库细胞在模拟实际生产条件下连续培养、扩增（逐级放大扩增过程）生产中细胞模拟培养至预期时间，以及超过预期时间之外的延长时间点，收获后进行检测分析15稳定性研究储存条件下的稳定性研究-细胞存活率、功能活性、库细胞稳定性检测方案传代/增殖过程中的稳定性研究-重在遗传稳定性考察、基因水平比较，目的产物表达水平比较，细胞自身稳定性，内源因子检查，致瘤性监测16细胞的考察和监控种子库细胞应进行全面质量研究和监测分析，模拟实际生产过程进行扩增培养，充分考察稳定性生产细胞须研究建立培养过程的监控标准，明确考察指标和要求终末期细胞目的基因表达应相对稳定，细胞生长状况、污染控制、致肿瘤风险在许可范围内17风险因素控制和处理工艺对于内源性逆转录病毒和/或致瘤性试验阳性的细胞，应依据工艺处理能力制订风险性成分的控制条件根据模拟生产状态下取得的试验研究数据指定废弃收获液的标准生产工艺必须包括有效的病毒和/或致瘤性成分的灭活/去除方法并经过充分验证18细胞培养工艺过程再验证在研究建立了培养生产条件之后，如果整个培养过程中的关键环节发生变化：例如培养基、培养条件、培养时间和/或限制代次、培养方式等发生重大改进：细胞培养工艺进一步放大，影响了原已确定的监控标准：需要重新调整设计技术参数和条件时应重复进行一次全面的的检测验证19生产过程控制-生产细胞增殖限度研究考察细胞体外连续扩增、培养过程中发生的变化，例如细胞的生长状态、内源性病毒抑制状态、目的蛋白表达的下降程度以及致瘤性改变等；确定适宜的收获方式、收获时间、细胞终止培养时间和/或增殖代次，并预留充分的安全储备；实际生产过程中细胞不得超过预先设定的培养时间和/或增殖限度。20生产过程控制-常规生产过程监控重点监测微生物污染和细胞生长状况活细胞数目和形态、代谢和功能状态目的蛋白表达状况、内源性逆转录病毒的复制、外源因子等在比较分析的基础上确定批次或者连续培养生产的终末细胞的监测项目及可接受标准21（三）生产细胞的控制要点•设立常规生产过程监控要求1•细胞增殖限度/连续培养时间须保持在研究确定的范围内2•严格控制风险性因素322细胞质控研究-早期变更相关研究1提交申报资料，前期的设计考虑应比较充分，基础研究相对成熟，生产工艺和技术条件比较稳定，能够从实验室水平成功转向产业化早期研究阶段库细胞、培养方式、扩增及维持培养等影响整体指令的重要技术环节应尽早研究确定，避免较大变动，放大研究的关键控制条件基本清楚，应能够为后续产业化规模生产提供技术衔接基础23细胞质控研究-早期变更相关研究2细胞株筛选，前期进行充分比较，慎重选择，申报前研究应比较成熟，具备产业化扩增培养的基础含牛血清培养转化到无血清培养基，建议尽早考虑，改换后应不影响细胞生长、表达的稳定性，可以是种子库细胞或者生产培养过程细胞，提交充分的研究资料培养规模和生产工艺扩大，达到预期设计目的，能有效转接或者转化到将来的时间生产过程24细胞质控研究-早期变更相关研究3传代限制，细胞代次、倍增水平，事先研究确定，预留扩展的余地致瘤性风险、外源因子激活、检测控制研究细胞培养方式批培养、流加、灌注，申报前应根据将来的设计需要经比较研究选定，具备产业化生产的基础质量标准拟定质量标准时，参考同类产品质控项目和标准要求，同时结合具体品种考虑，逐步完善提高25细胞质控研究-上市后变更相关研究11、变更引起产品内在质量发生改变的，需要按新药申报程序进行生病为I类，请参考《药品注册管理办法》附件4药品补充申请注册事项及申报资料要求2、变更可能对产品的安全和有效性有影响的为II类，须报SFDA审批3、一般不影响产品安全性和有效性的为III类，须报SFDA备案26细胞质控研究-上市后变更相关研究2生物制品生产工艺过程变更管理技术指导原则，国食药监注[2005]493号已经取得生产文号的生物制品生产过程等发生变更从开始生产至终产品的全过程，及与生产相配套的辅助设施包括原液制备，半成品配制及成品分装等27细胞质控研究-上市后变更相关研究3I类变更涉及情况原料或起始原材料原始种子库病毒灭活方法变更检定方法、质量标准主要生产设备如消毒、动感、分装、发酵罐、血液制品生产用离心机、压滤机28二、生产工艺研究2930细胞培养工艺收获液采集、处理目标产物纯化病毒灭活/去除工艺配置罐装工艺生产工艺研究（一）细胞培养工艺研究培养基选择、添加物的质量控制、培养条件研究种子细胞复苏、逐级扩增、污染监控有血清向无血清转化、适应过程的控制（生长、表达、收率等）维持、换液、传代、放大，培养过程监控影响修饰反应如糖基化、电荷异质体、完整抗体的主要因素；规模和方式，500-1000L，悬浮、贴壁；转瓶、培养袋、生物反应器；批式、灌注、流加31细胞培养（一）细胞培养工艺研究目的产物表达、产量和活性状态监控内源性病毒颗粒产生，致瘤性风险担保激活、表达32监控重点（三）目标产物纯化收获液质量控制采集时间、标准、方式预处理，合并、转移、贮存、无菌化控制防降解、聚合等必要的保护33收获液采集收获液加工（三）目标产物纯化常用分离纯化技术手段亲和层析、离子交换、分子排阻、反相疏水等；串联或者组合使用目的保留有活性、完整的抗体分子。控制异构体、异质体、聚合体；去除产品杂质（细胞残留成分、残余DNA）、工艺杂质（残余担保A、洗脱液伴随成分如咪唑、乙腈）、降低生物负荷（除菌、内毒素），灭活/去除病毒颗粒34纯化工艺研究（三）目标产物纯化纯化处理规模具体工艺参数和技术条件关键工艺步骤的纯化程度和收率去除效果考察如对于生物负荷（细菌、内毒素）、杂蛋白、工艺相关杂志等的分离去除关注重点聚合体、重链C端不均一，电荷不均一异质体，糖基化修饰不均一等影响抗体亲和力、特异性和免疫原性的重要问题结合质量分析研究的指标考察纯化工艺的实际效果35纯化工艺研究（四）病毒灭活/去除工艺及验证参照技术审评一般原则的的要求设计；包含去除/灭活病毒的有效工艺步骤；候选方法：低pH孵放、阴离子交换层析，亲和层析，纳米过滤技术；提供完整全面的验证报告；严格控制临床试验用药或上市产品的病毒安全性风险；36（五）纯化制备工艺和活性测定方法验证纯化制备工艺验证优化工艺条件和技术参数，确定纯化效率、收率及效能的稳定性活性测定方法验证建立多环节、多途径与机制或效应密切关联的生物活性测定方法例如免疫结合（抗原/抗体）、受体/配体激活（磷酸化/去磷酸化）、生物效应（增殖抑制、细胞凋亡）等方法，以IC50、ED50等定量方法式进行考察控制。37三、制剂处方研究38制剂处方研究•来源、依据和比较研究处方选择•冻干制剂、液体制剂，其他剂型；注射剂/非注射剂剂型的考虑•辅料对制剂稳定性影响，结合稳定性试验进行考察，辅料用量的合理性处方合理性39制剂处方研究辅料的选择应结合不同制剂、不同给药途径考虑，对于注射剂通常应：避免动物来源辅料的试验；不用动物水解明胶！减少对人白蛋白的使用；改用氨基酸成分！避免防腐剂的使用；静脉注射用血液制品禁止使用防腐剂！40制剂处方研究辅料来源、质量标准应符合药用辅料标准，聚山梨醇酯-20或聚山梨醇酯-80建议为植物来源；氨基酸的选择使用甘氨酸、精氨酸、组氨酸等应符合药用标准，注意作为辅料与质量药物在用量上的不同及合理性；缓冲液的选择磷酸盐、枸橼酸、醋酸盐缓冲对的选择及其对pH值的影响，渗透压的控制；41制剂处方研究制剂处方与内包材的相容性，应考虑选用上市生物制品已经大量使用、质量可靠的内包材和输注装置，对于新的没有临床使用经验的内包材应：满足输液用内包材基本要求的前提下，研究比较与内包材的相容性；关注与输注装置的相容性，如输液袋、管路系统等；配制时与输注溶液的相容性，配制后在输注装置内不同时间点质量分析研究；开启后尽可能一次配制输注，避免分次输注；42四、小结43小结国家局、药典会、药审中心等；选择以使用到临床或者生产阶段的宿主细胞；明确