感染性疾病实验诊断

感染性疾病实验诊断珠江医院微生物室主要学习内容及要求掌握：感染性疾病的常用实验检测项目及其临床意义和评价；各系统病原体检查的处理步骤；熟悉：各系统感染的常见病原体、常见疾病及病原学检测；了解：当今感染病特点与感染类型，常见医院感染病原体及特点。第一节概述一、感染性疾病的定义又称感染病，是由微生物（细菌、病毒、真菌）和寄生虫感染人体后机体组织细胞受到不同程度的损害并出现一系列的临床症状和体征。其中，有传染性的感染性疾病称为传染病。1、微生物变异所出现的新亚型、亚性、不典型株及耐药株已成为当今主要的病原体；2、感染患者多因免疫防御能力的下降感染；3、内源性感染与条件致病菌的感染增加，其中肠道菌群和口咽部菌群是最重要的内源性感染源。二、感染病特点1、按病原体分类：可分为细菌、病毒和真菌；2、按病原体来源分类：可分为内源性感染和外源性感染；3、按疾病特征分类：A.隐性感染（亚临床感染）、B.潜伏感染、C.显性感染（包括急性感染、慢性感染、局部感染、全身感染）、带菌状态、不感染。三、感染类型医院感染的定义：指来自医院或医疗机构的感染，包括在医院获得出院后才发生的感染，但不包括入院前已存在的感染，入院时已处于潜伏期的感染。入院48小时后发生的感染通常认为是医院感染。四、医院感染院感的特点：1、院感的感染链由感染源、传播途径和易感宿主构成，细菌是主要病原体，且多为异位菌和耐药菌；为此，采集时要防止人体定值菌及环境污染菌对标本的污染；鉴定时要鉴定到种并提供药物敏感性试验结果；2、所有分离自无菌部位的菌株、重要的耐药株和流行病学重要的菌株都要保存3—5年；四、医院感染四、医院感染院感的特点：3、当院感发生率增加而超过该时期的预计值时就称为爆发，爆发时应当及时进行环境卫生学检测。五、一般实验检测感染病的实验诊断包括一般实验室检查和病原学实验诊断，前者是感染病的首要检测项目，具有初筛的作用，常见项目如下：1、C—反应蛋白：鉴别诊断细菌或病毒感染的首选指标，还可判断抗生素疗效和预后；2、前降钙素原：PCT的升高程度与感染严重度及预后相关，在全身性细菌感染和脓血症的诊断方面有很高的临床价值；五、一般实验检测3、白细胞常规检查：A.白细胞上升：急性细菌感染（如G+C）、某些病毒感染（如传单）；B.白细胞下降：G+b（如伤寒、副伤寒沙门菌）、疟疾、病毒感染；C.嗜酸性粒细胞：寄生虫病；D.单核细胞增多：亚急性心内膜炎、疟疾；E.淋巴细胞增多：病毒感染、某些杆（如百日咳鲍特菌、结核杆菌、布氏杆菌）。五、一般实验检测4.器官功能改变的检测：不同系统感染导致检测其器官功能改变的项目不一，如诊断中枢神经系统感染的还需做脑脊液常规检测。第二节感染性疾病的病原检测一、标本采集和运输正确选择、采集与运输标本是病原学实验诊断的第一步，留取标本的质量关系到实验诊断的结果正确与否。错误的检验结果主要是发生在检验前，所以对不合格的标本要拒收并及时和临床沟通！二、病原检测的方法根据对与病原体相关的不同成分的检测，可以分为以下几种检测方法：直接显微镜检测病原体分离培养和鉴定病原体抗原检测病原体抗体检测病原体核酸检测细菌毒素的检测1、直接显微镜检查包括以下四种方式：检测方法主要用途方法评价涂片染色显微镜检查可以观察细菌、真菌的形态、染色性、排列和特殊结构，也可检查寄生虫简便快速、能提供初步诊断，对无菌体液尤其有诊断价值，应用很广泛涂片不染色显微镜检查可观察病原体的生长、运动方式、螺旋体形态和运动对螺旋体、梅毒、真菌的诊断比较有意义组织细胞形态学检查可以根据包涵体的特点，初步怀疑病毒或衣原体感染多数病毒在组织细胞呈非特异性，难以判断种属复染标本电镜观察和免疫电镜技术可以用来观察病毒颗粒临床上不常用2、病原体分离培养和鉴定病原体方法评价细菌选择合适的培养基培养，然后根据菌落性状和细菌的形态染色性作出初诊，最后可用自动化鉴定系统鉴定病原体的分离和鉴定是细菌、真菌和病毒感染性疾病诊断的金标准真菌接种于沙氏或脑心琼脂，根据真菌的菌落性状及菌丝孢子形态鉴定到种病毒将标本接种于体外培养细胞、易感动物或鸡胚，然后根据动物的发病情况或鸡胚中形成的特殊病灶作出初诊，最后用血清学鉴定3、病原体抗原检测用已知抗体，借助金标免疫、荧光免疫、酶免疫等技术检测未知的病原体抗原；病原体主要用途评价细菌脑脊液脑膜炎奈瑟菌、痰液中结核杆菌、衣原体、幽门螺旋杆菌等抗原在无菌或很少其他微生物的标本中较有意义真菌G实验、隐球菌和曲霉抗原的检测隐球菌抗原检测可作为确诊依据，其它的不可以病毒肝炎病毒抗原、AIDS的p24抗原、轮状病毒抗原、CMVpp65抗原、呼吸道病毒抗原有助于病毒的早期诊断，但需注意交叉反应4、病原体抗体检测用已知抗原，借助ELISA、凝集试验、胶体金标记EIA等技术检测病原体的抗体病原体常用方法评价细菌常用方法有凝集试验（肥达试验、外斐试验等）、胶体金标志试验、ELISA、间接免疫实验特异性免疫学实验很有诊断价值，但其特异性不能等同病原菌检出病毒ELISA应用最广泛，适用于大多数病毒，此外还有中和试验、补体结合试验、免疫印迹法等；可用来检测急慢性病毒感染，同时检测双份血清或lgM抗体较有意义真菌可用ID、CF、LA、EIA等检测曲霉、新型隐球菌、念珠菌等，但免疫低下患者检测往往无价值；有初筛意义，但敏感性和特异性均不高5、病原体核酸检测病原体核酸检测技术主要有PCR、实时荧光定量PCR和DNA探针杂交技术；评价：具有很高的敏感性，可用来判断病毒的活动性感染，细菌的鉴定、耐药基因检测和细菌分子流行病学调查，但容易造成假阳性或假阴性。6、细菌毒素检测内毒素检测：鲎实验是目前内毒素检测最敏感、最常用的方法，有助于判断细菌感染的严重程度；外毒素检测：免疫法是检测细菌外毒素最常用的方法，可用来检测艰难梭菌毒素A或B、大肠埃希菌Vero细胞毒素、金葡的肠毒素，对抗生素相关性肠炎很有意义。第三节系统感染的实验诊断一、血流感染血流感染的定义：病原生物通过各种途径进入血流，并通过血流造成全身播散，引起各种临床症状。血流感染常见的病原菌包括：G+C如葡萄球菌、链球菌和肠球菌属，G+b如肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌和流感嗜血杆菌，白念珠菌和脆弱杆菌也较常见。检测项目的选择：血常规+CRP+血培养鉴定血流感染的标本采集和运送血液标本：尽量在抗菌药物使用前采集，发热寒战者在寒战或体温高峰前0.5—1h采集，也可以在寒战发热1h后采集；一般24h内周期性地收集2—3次血标本培养。中心静脉导管标本：剪下5cm导管尖端或近心端，及时送到细菌室进行半定量平板滚动培养或定量培养血流感染的细菌检验程序血流感染的真菌检验程序血流感染的寄生虫检验采血制作血涂片、固定与姬氏或瑞氏染色可镜检找红内期阶段的疟原虫；对丝虫病、弓形虫病和锥虫病的诊断也有价值。血流感染检查的临床应用血培养阳性：可确诊血流感染，要及时涂片、革兰染色和镜检，报告到临床并分离培养鉴定到种；血培养阴性：血培养5d后仍未报阳，可报告“培养5天，未见细菌生长”血培养应注意假阳性和一过性菌血症，对比前后分离的菌株有助于判别；另外，动态监测BG的水平有助于判断疾病的发展和预后。二、中枢神经系统感染中枢神经系统感染的定义：指病原微生物侵犯中枢神经系统实质、被膜及血管等引起的急性或慢性炎症性（或非炎症）疾病，如脑膜炎、病毒性脑炎和脑脓肿。中枢感染的常见病原体：脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、新生隐球菌、乙型脑炎病毒、单词疱疹病毒等；检测项目选择：血常规+CRP+脑脊液生化项目+病原学检测（涂片镜检、培养鉴定、PCR、血清学试验等）中枢感染的细菌和真菌检验程序中枢系统病毒和寄生虫检测程序病毒检测程序：以血清学试验、核酸分子杂交及核酸扩增技术为主；寄生虫检测程序：取脑脊液沉渣涂片镜检，对阿米巴滋养体、弓形虫、疟原虫、广州管圆线虫幼虫有诊断意义。中枢感染检查临床应用1、脑脊液分离培养阳性：可确诊中枢神经系统感染。抗酸染色查见抗酸杆菌，革兰染色查见阴性双球菌，墨汁染色查见透亮菌体和宽厚荚膜均可报告。2、血清学有助于诊断，但要区分假阳性和假阴性；3、PCR对肠道病毒引起的病毒性脑膜炎很有意义；4、病毒性脑炎确诊有赖于脑活检病理发现细胞内包涵体、病毒核酸或脑脊液检测病毒抗原或抗体。三、呼吸系统感染呼吸系统感染：包括急性上呼吸道感染、急性气管—支气管炎、慢性支气管炎和肺炎。常见病原体：急性上呼吸道感染90%由病毒引起，细菌则以溶血性链球菌多见；肺炎80%由细菌引起，以肺炎链球菌、金葡、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体和肺炎衣原体多见。检测项目选择：血常规+CRP+痰培养鉴定+免疫学及核酸检测呼吸道标本采集和运送呼吸道的标本包括鼻咽拭子、痰、通过气管收集的标本（气管内吸出物、气管镜采集法），后者是理想标本。对于合格的痰标本才接收,当白细胞≤25个/LP，鳞状上皮细胞≥10个/LP,应当拒收；下呼吸道标本中一旦怀疑肺炎支原体、军团菌、双相型真菌、结核分支杆菌等即可认为是合格标本而直接进行病原鉴定。呼吸系统细菌、真菌检验程序呼吸系统病毒和寄生虫检验病毒检验：主要采用病毒培养、免疫学和分子生物学检测方法。在流感季节，应对免疫力正常成人进行流感病毒的检测；免疫力有缺陷的成人，应采用细胞培养和分子生物学方法检测；小于2岁的婴幼儿应进行呼吸道合胞病毒的检测；小于10的儿童应进行流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒的检测；寄生虫检验：痰液镜检对溶组织内阿米巴滋养体、卫氏并殖吸虫、粪类圆线虫幼虫、蛔蚴、钩蚴等检出有一定的意义。呼吸系统感染检查的临床应用痰涂片抗酸染色：对结核分枝杆菌有诊断意义；痰中有颗粒状、菌块和干酪样物质：对放线菌病和曲霉菌有诊断意义；检测出肺炎支原体、军团菌、双相型真菌、结核分枝杆菌：可认为是肺部感染的病原体；检出与正常菌相同的菌：涂片有大量中性粒细胞，培养后涂片镜检也为优势菌则由诊断意义；有感染症状、脓臭痰但普通细菌培养为阴性：提示厌氧菌感染。四、胃肠系统感染胃肠道感染：是以呕吐、腹痛、腹泻为临床特征的常见感染病，有食物中毒、霍乱、伤寒、细菌性痢疾、结肠炎、胃炎与抗生素相关性腹泻等。常见病原菌：A.侵袭性细菌：沙门菌、志贺菌（A群）、空场弯曲菌、大肠埃希菌（EPEC、EIEC）、幽门螺杆菌等；B.细菌毒素性细菌：霍乱弧菌、志贺菌（B、C、D群），大肠埃希菌（ETEC、EHEC、EAggEC）等；C.病毒：轮状病毒、杯状病毒等；D.真菌：白念珠菌、曲霉等。检测项目选择：血常规+免疫学+PCR/RT—PCR+病原体的分离培养鉴定胃肠道标本采集和运送应取脓血或粘液粪便置于清洁容器中尽快送检（不能超过2h），然后接种于选择培养基上；对于传染性腹泻患者需3次送检粪便进行培养；疑为寄生虫感染者，要尽快运送水样便以保持原虫滋养体活力，若不能及时送检，应用含10%甲醛和聚乙烯醇的小螺口塑料容器保存。胃肠道细菌检验程序胃肠道病毒和寄生虫检验病毒检验：主要采用ELISA或乳交凝集试验检测病毒抗原、用核酸杂交、PCR和RT—PRC法检测病毒核酸；血清学多用于流行病学调查。寄生虫检验：通过检测粪便中寄生虫的虫卵、幼虫、滋养体等对寄生虫感染进行诊断。胃肠道感染检查的临床应用粪便的直接镜检意义不大，胃肠道感染的诊断有赖于细菌分离与培养；胃粘膜活检标本直接镜检对幽门螺杆菌较大的意义；镜检观察各菌落的数量与球菌与杆菌的比例对诊断抗生素相关性腹泻有诊断价值；细胞毒素试验检测艰难梭菌的毒素是诊断引起抗生素相关性腹泻的金标准。五、肝脏感染肝脏感染：是由病毒、细菌和其他病原体引起的肝脏炎性损伤，主要包括肝炎和肝脓肿。常见病原体：肝炎主要由病毒和毒素所致，包括HAV、HBV、HCB、HDV、HEV和CMV；肝脓肿以细菌性多见，主要是化脓性细菌，阿米巴肝脓肿也较为常见。检测项目选择：血、尿、便、常规+肝功能生化+PCR+病原体涂片分离培养鉴定肝脏感染标本采集和运送肝炎病毒是肝脏感染的主要病原体，血清是检测肝脏病毒的最常用标本；细菌性肝脓肿多以兼性厌氧菌与厌氧菌混合感染为主，应注意厌氧菌的标本采集、运送和检验方法