血型的鉴定方法及操作全解

红细胞血型系统及其检测重庆医科大学临床血液教研室血型的发现1900年，ABO血型系统1940年，Rh血型系统KarlLandsteiner血型（bloodtype)狭义地讲，存在于红细胞上的特异性同种抗原。广义地讲，是人类遗传多态性的一种表现，血液中各种成分都有其各自型别。红细胞血型（系统，抗原）是存在于红细胞上的化学结构，化学本质是糖和多肽，是红细胞膜上的跨膜蛋白。存在于红细胞膜上（完全抗原），也存在于上皮细胞以及各种体液和分泌液中（半抗原）。RBC存在于体液、分泌液中红细胞血型抗体天然抗体、免疫抗体规则抗体、不规则抗体完全抗体，不完全抗体同种抗体，自身抗体天然抗体和免疫抗体天然抗体：ABO血型系统中，A型个体血浆中天然存在抗B，B型个体血浆中存在抗A。多数天然抗体是IgM型，最佳反应温度为室温或更低。免疫抗体：一般通过输血、妊娠、注射三种方式接受抗原刺激，多数免疫抗体是IgG型，最佳反应温度是37oC。天然抗体和免疫抗体特性比较规则抗体和不规则抗体规则抗体：ABO系统产生抗Ａ、抗Ｂ是有规律的。Landsteiner规律：Ａ型－抗Ｂ，Ｂ型－抗Ａ，Ｏ型－抗Ａ，抗Ｂ不规则抗体：除ABO系统外，其他系统产生的抗体均不符合上述规律。正常人血液中一般没有不规则抗体，又称为意外抗体（unexpectedantibody）。完全抗体和不完全抗体完全抗体：在盐水介质中能凝集红细胞抗体，多为IgM抗体。不完全抗体：能使红细胞致敏，但在盐水质中不能凝集红细胞，需要通过抗球蛋白法或其他非盐水介质法进行检测，多为IgG抗体。抗IgG同种抗体、自身抗体同种抗体：针对患者缺乏的抗原所产生的抗体即为同种抗体，如Rh阴性者输血后产生的抗Ｄ抗体。自身抗体：针对自身抗原产生的抗体，如引起自身免疫型溶血性贫血。红细胞血型红细胞血型分类：ISBT（TheInternationalSocietyofBloodTransfusion)2002年，29个系统，200多个抗原目前，30个系统，300多个抗原一、ABO血型系统1.ABO血型抗原和抗体特性2.ABO血型的遗传与生化（1）ABO基因型与表型A型——AA，AOB型——BB，BOAB型——ABO型——OA，B是显性基因，O是隐性基因ABO基因不是产生ABO抗原的遗传密码（2）ABO血型的生化合成H基因——α–L-fucocyltransferase，19chrA基因——α–N-acetyl-0-galactosaminyltransferase，9chrB基因——galactosyltransferase,9chrO基因——无效基因，不产生转移酶，O型红细胞含有H物质基因酶合成抗原思考：A、B、AB型红细胞是否存在H物质？（3）ABH可溶性抗原形成分泌型血型物质：ABH抗原存在于红细胞、内皮细胞、血小板、淋巴细胞、上皮细胞等，也可出现在除脑脊液外的分泌液中，唾液中最丰富。Se，se基因——与体液分泌有关，Se编码α–L-fucocyltransferase，形成分泌液中的H抗原，H也可转化为A或B抗原，Se不影响红细胞上ABH形成，Se为分泌型；se为非分泌型；19chr。分泌型血型物质的意义：在RBC抗原弱表达个体中确定ABO血型。检测唾液、羊水中的血型物质，辅助鉴定血型和预测胎儿血型。能中和天然抗体（IgM），有助鉴别Ab性质。3.ABO亚型：亚型：同一血型抗原的结构、性能（质）或抗原位点数（量）存在一定差异。A亚型：A1，A2，A3，Ax，Ay，AmB亚型：B1，B2，B3，Bx，Bm二、Rh血型系统1940年，Landerstein和Wiener用恒河猴（rhesus）RBC免疫家兔或豚鼠，得到一种抗体，可与85%白种人红细胞发生反应。Rh系统有50个抗原，最复杂，重要性仅次于ABO血型。1.遗传与发育规律胎儿早期充分发育，脐带血/新生儿红细胞同成人。基因位于1chr，分别命名为RHD，RHCE，RHD编码D抗原，RHCE编码不同组合的CE抗原，ce，cE，Ce，CE。2.命名和种类三种命名方式Fisher-Race、数字命名法、现代命名法Fisher-Race命名法（CDE命名法）3.Rh血型种类D、E、C、e、c抗原的强弱次序DECce5.Rh抗体Rh抗体产生天然抗体罕见主要通过输血和妊娠免疫产生IgG初次免疫后3~6月出现，再次免疫后3周达高峰Rh抗体种类抗D，抗E，抗C，抗c，抗eABO和Rh血型系统的临床意义安全输血的主要保证新生儿溶血病的诊断器官移植的必要条件其他：遗传学研究，法医学鉴定四、ABO和Rh血型鉴定常用方法：盐水介质法、酶介质法、抗人球蛋白法、聚凝胺法试管法、玻片法、微柱凝胶法1.盐水介质法（saltmediumtest）原理：根据IgM类抗体与红细胞膜上特异性抗原能发生凝集反应。正定型：已知血型抗体试剂+红细胞反定型：已知标准红细胞+血清鉴定红细胞上血型抗原鉴定血清中抗体反应条件：生理盐水介质，室温，肉眼可见凝集反应平板法，试管法，微孔板法，试管离心法最可信赖。应用：ABO血型定型、RhD抗原定型（IgG+IgM，IgM单克隆抗体），交叉合血结果判断注意事项（一）：标准血清：健康壮年人混合血清，培养细胞株的单克隆抗体要求：高效价：抗A、抗B≥1：128高亲和性：15s内出现凝集，3min后凝集块1mm2单克隆抗体具有检出A2，A2B的能力冷凝集素效价1：4无菌，病毒灭活注意事项（二）：红细胞试剂：三个健康者同型新鲜红细胞混合，用生理盐水洗涤三次。红细胞悬液不能过浓或过淡，5%生理盐水红细胞悬液注意事项（三）：所有器材清洁干燥一般先加血清，后加红细胞反应温度：IgM抗体反应最适温度为40C，为防止冷凝集素干扰，采用室温，370C反应减弱离心时间和速度：3000g,30s反定型不宜用玻片法结果核对，避免笔误正、反定型结果一致才能报告，否则查找原因正反定型不一致的可能原因（一）：操作技术上的错误：主要原因离心过度或不足细胞与血清反应比例不适当阳性反应产生溶血现象而未能识别漏加试剂、结果判读错误等正反定型不一致的可能原因（二）：出现假阴性的常见原因：某些白血病患者和难治性贫血等导致ABO抗原减弱；免疫系统尚未健全的新生儿、4月~6月内婴儿、抗体水平下降的老人；亚型红细胞抗原性弱，难以检出；低丙种球蛋白血症患者，血清定型时不凝集或弱凝集。正反定型不一致的可能原因（三）出现假阳性的常见原因：红细胞出现多凝集现象；严重肠道革兰氏阴性杆菌感染，可使红细胞获得类B现象；异常的血浆蛋白升高、白蛋白/球蛋白异常，高浓度纤维蛋白原造成假凝集现象；待检血清中有不规则抗体存在；右旋糖酐、静脉注射某些造影剂等引起红细胞类似凝集。方法学评价简单，灵敏度低，只适合IgM抗体试管法：需时短，离心增强凝集，可发现亚型和较弱的反应，正、反定型皆适合玻片法：适合大规模血型普查，反应时间长，有时漏掉弱反应，反定型不适合。2.酶介质法（enzymicmediumtest）：原理和方法：主要用于Rh血型鉴定（IgG抗体）蛋白水解酶增强IgG抗体的凝集作用注意事项：Rh血型不需作反定型每次实验均需作阳性、阴性对照方法学评价简单经济稳定性、准确性较差，不能检出MN、Duffy血型系统3.抗人球蛋白实验（Coomb’stest）原理和方法抗IgG待测红细胞+抗RhD（IgG）+抗人球蛋白红细胞凝集应用延伸：检测红细胞同种抗体的经典方法，新生儿溶血、病、溶血性输血反应、自身免疫性溶血性贫血直接Coomb’s（directantiglobulintest,DAT）间接Coomb’s（indirectantiglobulintest,IDAT）DAT：检查红细胞是否致敏IDAT：检测血清中不完全抗体4.聚凝胺介质法（polybrenetest）原理和方法低离子强度盐溶液（lowionicstrengthsaltsolution,LISS)：降低介质离子强度，增加抗原抗体结合聚凝胺：中和红细胞表面负电荷，使红细胞发生非特异性凝集。重悬液（resuspension)方法学评价适于各类抗体（IgM，IgG）快速、灵敏、可靠对检测Kell血型系统抗体不理想，不能用肝素抗凝。5.微柱凝胶法(gelcardswithmicrotubes)1986年法国人Dr.YvesLappierre发明1994年，获美国FDA认证原理和方法葡聚糖做成微型凝胶柱，上端为反应室，下端凝胶柱为抗原抗体凝集反应的介质。抗原与抗体结合后离心，经过凝胶分子筛作用，游离红细胞在凝胶底部，而与抗体结合凝集的红细胞位于凝胶上部或悬浮于凝胶中。反应室凝胶柱结果判读：阳性结果：红细胞凝集块位于凝胶表面或凝胶中，和（或）出现溶血。注意事项：专用水平离心机假阳性：镰型红细胞、巨幼红细胞白细胞过多纤维蛋白原未完全去除细菌污染，血浆蛋白异常假阴性：抗原抗体比例不合适不适用于直接Coombs阳性的红细胞标本、酶处理的红细胞标本方法学评价灵敏度和准确性高，实验结果重复性好，可长时间保存自动化程度高，实验过程标准化，ISO9000/CE认证成本高应用延伸：用于ABO正反定型，交叉配血、其他血型抗原检测（CcEe）、不规则抗体检测、Coombs实验凝胶柱中性胶抗人球蛋白胶特异性胶三、交叉配血（crossmatching）定义检测意义是安全输血的重要步骤进一步验证血型鉴定是否正确发现ABO、Rh血型以外的其他抗体常用方法及评价结果判断（同型输血）主侧、次侧管均无凝集、无溶血，表示配血相容，献血者血液可以输注；出现主侧、次侧试管或单独一侧试管内红细胞凝集和（或）溶血，则表明两血不相容，献血者血液不可输注。同型输注是输血的基本原则紧急情况下