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RNA提取高级生化与分子生物学研究技术目录1、试剂介绍2、主要提取流程3、详细步骤4、注意事项1、试剂介绍本实验室提取RNA常用的抽提剂是全式金Trizol。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂,可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。Trizol在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性,因此对纯化RNA及标准化RNA的生产十分有用。2、主要提取流程磨样加氯仿转移水相加乙醇室温晾干保存溶解RNA测浓度胶状物加Trizol去杂质1、剪取新鲜幼嫩叶片,置于液氮中慢慢反复研磨,直至其成为合格粉末为止。2、加入1mlTrizol,晃动3-5下,再用枪吹打2-3下,确保全部裂解。3、室温放置5分钟,使样品充分裂解。12,000g、4℃离心10分钟。4、每毫升Trizol加入0.2ml氯仿,猛烈晃动15秒,室温放置2-3分钟。5、12,000g4℃离心15分钟,然后吸取上层无色水相至一新的离心管中。3、详细步骤6、按1ml最初的Trizol加入0.5ml异丙醇,颠倒数次混匀,室温沉淀10分钟。7、12,000g、4℃离心10分钟,弃上清,在管底可见RNA沉淀(透明胶状)。8、每毫升最初的Trizol加入1ml75%乙醇(DEPC水配制),剧烈震荡。9、7,500g、4℃离心5分钟,弃上清。再用离心机甩一下(5,000rpm,离心1分钟),小心吸尽液体。10、待RNA略干后,加入20µlDEPC水溶解,-80℃冻存。4、注意事项1、所有离心管,枪头及相关溶液都必须无RNA酶污染。耐高温器物可放置于150℃烘烤4小时以去除RNA酶,其它器物去除RNA酶可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜,然后灭菌,烘干。溶液需用DEPC水配制。2、必须戴一次性口罩和一次性手套操作。尽量不要对着RNA样品呼气或说话,以防RNA酶污染。3、提取RNA整个过程中,尽量在低温下操作。4、在操作中当加入变性剂氯仿后,须剧烈震荡,这样才能彻底使两相混匀。5、在提取核酸时,如样品浓度低,则应增加有机溶剂沉淀时间,-80℃下30min或-20℃过夜将有助于增加核酸的沉淀量。6、切勿让RNA过分干燥,否则将难溶解。谢谢老师的评阅!
本文标题:RNA提取详细步骤及注意事项
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