全国20个主要产地茯苓质量分析比较研究

·34·ChineseJournalofInformationonTCMAug.2010Vol.17No.8·中药研究与开发·全国20个主要产地茯苓质量分析比较研究昝俊峰1,徐斌1,於小波1,苏玮2,王克勤2,刘焱文1(1.湖北中医学院中药资源与中药复方省部共建教育部重点实验室,湖北武汉430061；2.湖北省中医药研究院,湖北武汉430073)摘要：目的建立茯苓多糖和茯苓酸的含量测定方法,分析比较全国20个主要产地茯苓中茯苓多糖和茯苓酸的含量,为评价不同产地茯苓的质量品质提供依据。方法采用分光光度法测定茯苓多糖的含量,碱提,苯酚-浓硫酸显色,葡萄糖为对照品,检测波长490nm。采用RP-HPLC法测定茯苓酸的含量,Kromasil100-5C18色谱柱,柱温30℃,流动相为乙腈-0.2%甲酸(80∶20),流速1.0mL/min,检测波长242nm。结果葡萄糖在40～200µg/mL范围内线性良好,r＝0.9999,平均回收率为99.72%,RSD＝0.99%；茯苓酸在0.48～2.40µg范围内与其色谱峰面积呈良好线性关系,r＝0.9997,平均回收率100.26%,RSD＝1.26%。不同产地茯苓药材中茯苓多糖和茯苓酸的含量有较大差异,说明药材质量并不一致。结论该方法简便快速、准确可靠,为评价不同产地茯苓药材的质量提供了一种可靠的分析方法。关键词：茯苓；茯苓多糖；茯苓酸；分光光度法；高效液相色谱法DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2010.08.016中图分类号：R284.1文献标识码：A文章编号：1005-5304(2010)08-0034-03ComparativeStudyontheQualityofPoriaCocosfrom20DifferentOriginPlacesZANJun-feng,XUBin,YUXiao-bo,etal(ProvincialandMinistryofEducationKeyLaboratoryofResourceScienceandChineseHerbalCompound,HubeiCollegeofTCM,Wuhan430061,China)AbstractObjectiveToestablishamethodfordeterminingthecontentofeffectiveingredientpachymaranandPachymicacidinPoria,comparethecontentofpachymaranandPachymicacidofPoriacocosfromdifferentoriginplaces,andprovideanevidencetoevaluatethequalityofPoriacocos.MethodsSpectrophotometrymethodwasusedfordeterminationofpachymaran,withphenol-sulfuricacidcolor,glucoseasthestandardandthedetectionwavelengthat490nm.RP-HPLCmethodwasusedfordeterminationofPachymicacidinPoria.ThechromatographicconditionswereKromasil100-5C18column,acetonitrile-0.2%methanoicacid(80∶20)asmobilephase,flowratebeing1.0mL/min,columntemperatureat30℃,anddetectionwavelengthat242nm.ResultsGlucose(40～200µg,r＝0.9999)andPachymicacid(0.48～2.40µg,r＝0.9997)showedafinelinear.TheaveragerecoveryrateofPachymicacidwas100.26%withRSD＝1.26%.TherewasadifferenceinthecontentofpachymaranandPachymicacidofPoriacocosfromdifferentoriginplaces,suggestingthatthequalityofPoriacocoswasdifferent.ConclusionThemethodiseasy,speed,accaruteandreliable.ItprovidesananalysismethodtoevaluatethequalityofPoriacocosfromdifferentoriginplace.KeywordsPoria；pachymaran；Pachymicacid；spectrophotometry；HPLCintercellularadhesionmolecule-1(ICAM-1)[J].SwissSurgSuppl,1996,1：41－45.[7]孙杰,郭振辉,赖添顺,等.山莨菪碱对血管内皮细胞损伤保护机制的实验研究[J].军事医学科学院院刊,2008,32(2)：137－161.[8]PrintsevaOY,PecloMM,GownAM.VariouscelltypesinhumanatheroscoeroticlesionsexpressICAM-1；Furtherimmunocytochemicalandimmunochemicalstudiesemployingmonoclonalantibody,10F3[J].AmJPathol,1992,140(4)：889－896.[9]ZhangRL,ChoppM,Zaloga,etal.ThetemporalprofilesofICAM-1proteinandmRNAexpressionaftertransientMCAocclusionintherat[J].BrainRes,1995,682(1/2)：182－188.[10]WangX,YueTL,BaroneFC,etal.Demonstrationofincreasedendothelial-leukocyteadhesionmolecule-1mRNAexpressioninratischemiccortex[J].Stroke,1995,26(9)：1665－1669.[11]LindsbergPJ,CarpenO,PaetauA,etal.EndothelialICAM-1expressionassiociatedwithinflammatorycellresponseinhumanischemicstroke[J].Circlulation,1996,94(5)：939－945.(收稿日期：2010-01-21,编辑：华强)2010年8月第17卷第8期中国中医药信息杂志·35·茯苓是多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核,具有渗湿利尿、和胃健脾、宁心安神的功效；主要用于治疗小便不利、水肿、脾胃气虚、食少便溏、体倦乏力及心神不宁、惊悸、失眠等症。药理研究表明,茯苓具有抗肿瘤、调节免疫功能、抗炎、抗过敏等生物活性[1]。我国茯苓资源分布广泛,主要来源于湖北、安徽、云南、四川、广西、福建、贵州等省区,浙江、陕西、河南、广东等省区亦有栽培。由于各地的生态环境存在差异,所产茯苓药材的品质良莠不齐。为了有效控制茯苓药材的质量,本试验分别采用紫外-可见分光光度法、反相高效液相色谱法对全国不同产地茯苓中茯苓多糖和茯苓酸的含量进行了综合比较研究,为评价茯苓药材的质量提供了理论依据。1仪器与试药SHIMADZUUV-2041PC紫外-可见分光光度计、电子控温水浴锅。Agilent1100液相色谱仪,紫外检测器,Agilent色谱工作站；KQ3200DE型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；sartonus型电子天平(十万分之一,德国)。茯苓酸对照品为本实验室自制,其纯度大于98%；茯苓药材分别采自湖南、河南、四川、浙江、贵州、安徽、湖北、广州、福建、云南、广西等20个产地,经湖北省中医药研究院王克勤教授鉴定为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf。浓硫酸、苯酚(分析纯)、葡萄糖标准品(购于中国生物药品制品检定所)。乙腈为色谱纯,水为重蒸馏水,其他试剂均为分析纯。2茯苓多糖的含量测定2.1供试品溶液的制备取新鲜茯苓菌核,去表皮得白色菌核,菌核切块,干燥,粉碎,过60目筛得茯苓粉末。精密称取不同产地茯苓粉末1.0000g,加25mL石油醚于70℃水浴中回流2h,冷却,过滤,滤渣干燥后加0.1mol/LNaOH溶液100mL,搅拌1h(＜5℃),混合溶液以3500r/min离心15min,取上清液。上清液用10%冰乙酸溶液调pH值5～6,使其成糊状,将糊状物离心处理,弃上清液,残留物置透析袋中用蒸馏水洗涤12h,以同样方法离心,得白色胶状沉淀,即为茯苓多糖。将茯苓多糖置于200mL量瓶中加水溶解至刻度,缓慢搅拌均匀,吸取0.5mL置于10mL容量瓶中,用水稀释至刻度,即得茯苓多糖供试品溶液。2.2对照品溶液的制备精取105℃干燥至恒重的葡萄糖0.025g,置于25mL棕色容量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,取1.00mL置5mL棕色容量瓶中,加水稀释制成0.2mg/mL的溶液,作为贮备液,备用。2.3标准曲线及线性范围分别精密吸取葡萄糖对照品溶液40、80、120、160、200µg/mL溶液各2.0mL置20mL试管中,分别加入5%苯酚溶液1.75mL,充分混合后,再分别缓慢加入6.00mL浓硫酸溶液,迅速摇匀,室温下放置40min,在分光光度仪上于490nm处测定样品溶液的吸收值,以浓度(C)对吸收值(A)进行线性回归,计算,得回归方程：A＝0.0044C＋0.0256(r＝0.9999),基金项目：国家自然科学基金(O30970295)通讯作者：刘焱文,Tel：[phone]葡萄糖在40～200µg/mL范围内线性良好。2.4精密度试验精密吸取对照品溶液1.0mL,按选择条件测定吸收值5次,吸收值依次为0.439、0.437、0.437、0.438、0.438,RSD＝0.19%(n＝5),表明仪器精密度良好。2.5稳定性试验精密吸取1.0mL供试品溶液,于0、1、2、4、8、24h按选择条件测定吸收值,吸收值依次为0.437、0.438、0.439、0.439、0.439、0.441,RSD＝0.31%(n＝6),表明供试品溶液在24h内检测稳定。2.6重复性试验精密量取供试品溶液1.0mL,共5份,按选择条件测定吸收值,吸收值依次为0.436、0.445、0.436、0.427、0.443,RSD＝1.48%(n＝5),表明本方法重复性好。2.7加样回收率试验精密称取已知含量的供试品溶液6份,每份0.25g,分别准确加入一定量的葡萄糖对照品,按“2.1”项下方法制成供试品溶液,精密量取各供试品溶液0.5mL,按选择条件测定吸收值,计算回收率。平均回收率为99.72%,RSD＝0.99%,表明方法稳定可行。结果见表1。表1加样回收率试验结果(n＝6)取样量(g)含量(g)加入量(g)实测量(mg)回收率(%)平均值(%)RSD(%)0.25030.16420.15020.3149100.330.25010.16420.15000.313299.330.25030.16420.15010.312498.730.25000.16410.15020.3163101.3399.720.990.25040.16430.15020.312798.800.25040.16430.15010.314199.802.8样品测定取茯苓多糖供试品溶液2.0mL置20mL试管中,分别加入5%苯酚溶液1.75mL,充分混合后,再分别缓慢加入6.0mL浓硫