药品质量标准分析方法验证解析

药品质量标准分析方法验证及检验知识培训1、分析方法的验证2、分析方法的确认3、分析方法的转移4、方法验证、方法确认和方法转移的文件管理第一部分：药品质量标准分析方法验证主要包括以下内容：第十二条质量控制的基本要求：（四）检验方法应当经过验证或确认；第一百三十九条企业的厂房、设施、设备和检验仪器应当经过确认，应当采用经过验证的生产工艺、操作规程和检验方法进行生产、操作和检验，并保持持续的验证状态。第一百四十二条当影响产品质量的主要因素，如原辅料、与药品直接接触的包装材料、生产设备、生产环境（或厂房）、生产工艺、检验方法等发生变更时，应当进行确认或验证。必要时，还应当经药品监督管理部门批准。第一百四十三条清洁方法应当经过验证，证实其清洁的效果，以有效防止污染和交叉污染。清洁验证应当综合考虑设备使用情况、所使用的清洁剂和消毒剂、取样方法和位置以及相应的取样回收率、残留物的性质和限度、残留物检验方法的灵敏度等因素。第一部分：药品质量标准分析方法验证法规要求：药品生产质量管理规范第一百四十七条应当根据确认或验证的对象制定确认或验证方案，并经审核、批准。确认或验证方案应当明确职责。第一百四十八条确认或验证应当按照预先确定和批准的方案实施，并有记录。确认或验证工作完成后，应当写出报告，并经审核、批准。确认或验证的结果和结论（包括评价和建议）应当有记录并存档。第一百四十九条应当根据验证的结果确认工艺规程和操作规程。第一百六十二条质量标准、工艺规程、操作规程、稳定性考察、确认、验证、变更等其他重要文件应当长期保存。第二百二十三条物料和不同生产阶段产品的检验应当至少符合以下要求：（一）企业应当确保药品按照注册批准的方法进行全项检验；（二）符合下列情形之一的，应当对检验方法进行验证：第一部分：药品质量标准分析方法验证法规要求：药品生产质量管理规范1.采用新的检验方法；2.检验方法需变更的；3.采用《中华人民共和国药典》及其他法定标准未收载的检验方法；4.法规规定的其他需要验证的检验方法。（三）对不需要进行验证的检验方法，企业应当对检验方法进行确认，以确保检验数据准确、可靠；（四）检验应当有书面操作规程，规定所用方法、仪器和设备，检验操作规程的内容应当与经确认或验证的检验方法一致；第二百三十条产品的放行应当至少符合以下要求：（一）在批准放行前，应当对每批药品进行质量评价，保证药品及其生产应当符合注册和本规范要求，并确认以下各项内容：1.主要生产工艺和检验方法经过验证；第一部分：药品质量标准分析方法验证法规要求：药品生产质量管理规范方法验证就是根据检验项目的要求，预先设置一定的验证内容和验证标准要求，并通过设计合理的实验来验证所采用分析方法是否符合检验项目的要求。•建立质量标准时，应对分析方法中的各检验项目进行完整的验证；•当药品生产工艺变更、制剂的组分变更、原分析方法修订时，可根据变更的内容决定对分析方法进行部分验证还是完整的验证；•当原料药合成工艺发生变更时，可能引人新的杂质，杂质检査方法和含量测定方法的专属性就需要进行验证，以证明有关物质检查方法能够检测新引入的杂质，且新引入的杂质对主成分的含量测定应无干扰；•当质量标准中某一项目分析方法发生部分改变时，如采用高效液相色谱法测定含量时，检测波长发生改变，则需要重新进行检测限、定量限、专属性、准确度、精密度、线性等内容的验证，证明修订后的分析方法的合理可行；•当变更达到一定程度时，则需要完整的验证。如分析方法完全改变，则应按新方法进行完整的验证。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证的一般原则：通常情况下，分析方法需进行方法验证。对于仅需按照实验室日常测试操作步骤即可测定的检验项目不需要进行验证，如外观、崩解时限、密度、重量、pH值、灰分、装量等。方法验证的内容应根据检验项目的要求，结合所采用分析方法的特点确定。同一分析方法用于不同的检验项目会有不同的验证要求。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证需要验证的检验项目检验项目是为控制药品质量，保证药品安全有效而设定的测试项目。根据检验项目的设定目的和验证内容的不同要求，将需验证的检验项目分为四类：•鉴别试验；•杂质的限度检查；•杂质的定量测定；•含量测定，包括原料药或制剂中有效成分的含量，制剂中其他成分（如防腐剂等）的含量，溶出度与释放度等检查中的溶出量，以及含量均匀度。除此之外还有一些物理项目的检测如粒径分布、旋光度、熔点和硬度，其要求与其他检验项目有所不同，通常其分析方法验证应有不同的要求。鉴别的目的在于判定被分析物是目标化合物，而非其他物质。用于鉴别的分析方法要求具有较强的专属性和耐用性。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证杂质检査主要用于控制主成分以外的杂质，如无机杂质、有机杂质等。杂质检查分为限度检査和定量测定两部分。用于限度检査的分析方法验证侧重专属性、检测限和耐用性。用于定量测定的分析方法验证强调专属性、准确度、精密度、线性、范围、定量限和耐用性。含量测定对准确度要求较高，因此所采用的分析方法要求具有一定的专属性、准确度和线性等要求。《中国药典》2010年版中规定了不同的检验项目需要验证不同的内容，详见下表：第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证检验项目和验证内容第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证验证内容检验项目鉴别杂质测定含量测定定量限度准确度否是否是精密度重复性否是否是中间精密度否是*否是*专属性**是是是是检测限否是***是否定量限否是否否线性否是否是范围否是否是耐用性是是是是备注：1.*:已有重现性验证，不需验证中间精密度；2.**：如一种方法不够专属，可由其他分析方法予以补充；3.***：视具体情况予以验证；4.“是”代表该项内容需要验证，“否”代表该项内容不需要验证。方法验证内容（本次主要介绍HPLC法含量测定方法的验证过程）1、色谱方法开发流程主要包括以下步骤：选择分离模式选择色谱柱和填料规格选择流动相溶剂如果分离模式需要，调节流动相的pH值进行等度或梯度初步实验，以确定边界条件优化实验条件第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证模式选择通常分离模式是由以上因素决定：目标物的类型和溶解度、目标物分子量（MW）、样品基质以及可使用的固定相和色谱柱。如：分子量＜2000在有机相中选择正相、反相，在水相中选择反相、离子对试剂反相或离子交换；分子量＞2000在有机相中可选择凝胶渗透，在水相中选择凝胶过滤、大孔填料的离子交换或大孔填料的反相色谱。又如：在水相/有机相中单糖和二糖可采用正相氨基、离子交换，多环芳烃采用反相C18，有机酸采用配位相互作用反相离子对，碱性、极性化合物采用极性反相C8、C18或反相C18离子抑制，位置异构体采用反相C8，强极性化合物采用HILIC模式；在有机相非极性化合物采用正相Si，极性化合物采用正相氨基、氰基。在水相中合成的多分散性聚合物并限定分子量范围采用体积排阻，合成多肽采用反相，聚合物采用水相GPC，重组多肽和Pr采用反相、阴离子或阳离子交换；在有机相中合成的多分散性聚合物和其它可溶于有机溶剂的聚合物采用凝胶渗透，低聚物采用反相。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证选择色谱柱和填料规格通常我们需考虑色谱柱固定相孔径、填料的粒径、长度和内径。要进行高通量分析可采用小粒径短柱（如亚2μm）若对包括多种组分的样品进行复杂的分离，可以选择小颗粒长柱。若要进行高灵敏度分析可采用2.1mm内径的色谱柱。填料的孔径非常用重要，因为待测分子必须与多孔结构“相匹配”，才能与固定相发生相互作用。较小孔径的填料（孔径80到120Å）适合分离分子量2000以下的小分子，对于分子量超过2000的较大分子，需要使用较大孔填料；例如：分离Pr的常孔径是300Å。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证选择流动相溶剂（介绍反相）流动相主要由两部分组成：1、水：可含缓冲液，或用酸或碱调节pH值2、可与水混溶的有机溶剂反相色谱有多种用途，有时在同一色谱分析中就可以分离非极性、极性、可离子化的和离子型分子。一般来说，对于可离子化的化合物，为了增加保留和改善峰形，我们会在流动相中加入改性剂，以抑制离子化，减弱其极性，使其保留更强。一般来说，反相LC的流动相包括水（190nm）和作为改性剂的乙腈（190nm）或甲醇（205nm）,不太常用的改性剂还有四氢呋喃（THF212nm）和异丙醇（205nm）。选择性差异和样品的保留都会因流动相不同而明显改变。样品溶解度也很可能不同，需要使用特殊的溶剂或多种溶剂。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证在反相色谱中，流动相中水相的pH和离子强度在开发对条件微小变化不敏感的耐用方法中非常重要。对于离子型化合物，典型样品的保留随pH改变而明显变化。在这类反相系统中，控制pH对于保留和选择性的稳定非常重要。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证用流动相改性剂控制pH流动相pH对色谱分离的影响有多种方式。根据所分析的化合物，pH可能影响选择性、峰形和保留。如果是非极性较强或中性的化合物，pH对分离度和保留的影响一般不明显。如果是酸性分析物，应选择低pH缓冲液流动相，以防止分析物离子化。了解分析物的pKa，才能够有效地选择流动相pH。缓冲范围应在其缓冲液离子pK值的+/-1pH单位，使流动相的优化具有一定的灵活性。例如，醋酸盐的pKa为4.8，缓冲范围从pH3.8-5.8。甲酸盐的酸性较大，缓冲范围为pH2.8-4.8。对于碱性化合物而言，在高pH条件下才能得到其非离子化形态，但这对色谱柱不利。但许多碱性化合物在低pH条件下的保留就已经足够了。因此，虽然非离子化形态能得到更高的保留，但这对与所有的碱性化合物并不是实用和必要的。UV检测器常用的缓冲液：磷酸及其盐类具有良好的低UV透光率（＜200nm），和乙腈（190nm）一起，成为许多方法开发工作者的首选。对碱的分离，可以选择TEA（＜200nm）-磷酸盐。磷酸盐在有机相比例高的溶剂中溶解度较低，针对这一缺陷，建议磷酸盐缓冲液与有机溶剂混合时，有机相不要超过70%。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证优化反相色谱条件在确定了色谱柱规格、合适的固定相柱填料、流动相溶剂和改性剂后，即可开始优化方法。方法的优化是根据最终目标决定的。如果要开发质量控制方法，您可能会需要像等度分离这种可变因素较少的方法。如果目标是得到最高分离度，节省分析时间并不是首要问题，可以选择长柱使所有组分都得到最大分离度。如果分离速度很重要，则应使用短柱和高流速。对于含许多保留不同的目标化合物的复杂样品，用等度分离可能不能解决问题，应开发并优化梯度方法。等度优化的一般方法是不断改变流动相强度（%B），直到获得适当的保留范围。这种方法有时也称为“溶剂筛查”。对于简单的分离，k值应在1到10之间。如果k值太低（比如，1），早洗脱的色谱峰可能不发生保留峰或融入基质组分，因此对其进行定量将非常困难而且不可重复。另外，低k值峰受柱外效应影响很大，可能会使峰展宽。如果k值太大（比如，10），分析时间将变得过长，检测限会因峰展宽而提高。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证对于反相色谱中的等度方法开发是从流动相有机改性剂最高比例开始，然后逐渐降低。在降低流动相强度之前，先要确定所有组分都已从柱中洗出。如果组分保留在色谱柱中，以后可能在B相比例较低的流动相中洗脱，成为无法解释的“鬼峰”。通常，流动相以+/-10%（如，90%B、80%B、70%B等）或+/-20%的幅度改变。一旦建立优化条件，如果目标还没有得到完全分离，则需继续提高选择性(α)。如需分离两个相邻的色谱峰会涉及到许多实验参数的调节。温度可以作为一个变量。大多数现代仪器都具有某种类型的柱温控制器，大部分反相柱可以承受高达60℃的温度，有些甚至更高。一般来说，升高温度可以缩短所有峰的保留时间，但对有些峰的影响可能与对其它峰不同，从而导致