环状RNA(circRNA)研究技术手册.doc

环状RNA(CircRNA)研究技术手册1CircularRNA研究技术手册一、环状RNA概述何谓环状RNA（circRNAs）？circRNAs（CircularRNAs，环形RNA分子）是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。circRNA是区别于传统线性RNA的一类新型RNA，具有闭合环状结构，大量存在于真核转录组中。大部分的环状RNA是由外显子序列构成，在不同的物种中具有保守性，同时存在组织及不同发育阶段的表达特异性。由于环状RNA对核酸酶不敏感，所以比线性RNA更为稳定，这使得环状RNA在作为新型临床诊断标记物的开发应用上具有明显优势。环状RNA研究的历史？1971年。研究者在马铃薯纺锤块茎病的研究中，发现类病毒（Viroids）能侵染植株并导致死亡。与病毒不同的是，类病毒没有蛋白质外壳包被，基因组是单链、闭合、RNA分子。1979年洛克菲勒大学的Hsu和Coca-Prados在电子显微镜下观察到的真核细胞细胞质中观测到环状RNA的存在。环状RNA(CircRNA)研究技术手册21993年在小鼠精子决定基因Sry中发现环状转录。2006年在果蝇中发现来自于Muscleblind的未知环状转录本。2012年，Salzman通过RNA-Seq方法首次报道了~80个环状RNA。至此借助于高通量测序技术，环状RNA(circularRNA)验明正身进入科研视界。大量的circRNA分子被相继发现，Jeck等在人类成纤维细胞中检测出了高达25000多种的circRNA；而Memczak等通过RNA-seq数据结合人白细胞数据库鉴定出1950种人类circRNA、1903种小鼠circRNA(其中81种与人类circRNA相同)和724种线虫circRNA。虽然circRNA大规模研究时间不长，但重量级文章陆续在NSC等期刊上发表，研究热潮已然升起。环状RNA(CircRNA)研究技术手册3CircRNA时间轴环状RNA主要有哪些类型？目前发现的circRNA主要来源于基因外显子，但多项研究也表明circRNA的类型比想象的要复杂，可以来自基因组上多种基因结构。环状RNA(CircRNA)研究技术手册4同一基因位置可以产生不同类型的环状RNA环状的RNA主要特征有哪些？(1)circRNA由特殊的可变剪切产生，大量存在于真核细胞的细胞质中，但少部分内含子来源的circRNA则存在于核酸内，具有一定的组织、时序和疾病特异性;(2)广泛存在于人体细胞中，有时甚至超过它们线性异构体的10倍之多;环状RNA(CircRNA)研究技术手册5(3)与传统的线型RNA(linearRNA，含5＇和3＇末端)不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不易被核酸外切酶RNaseR降解，比线性RNA更稳定;(4)具有高度保守性，部分具有快速的进化性改变;(5)大多数来源于外显子，少部分由内含子直接环化形成;(6)部分circRNA分子含miRNA应答元件(miRNAresponseelement，MRE)，可充当竞争性内源RNA(competingendogenousRNA，ceRNA)，与miRNA结合，在细胞中起到miRNA海绵的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，上调靶基因的表达水平;(7)可以翻译成蛋白质，但大部分是非编码RNA。环状RNA的形成机制是什么？circRNA通过非经典剪接方式进行反向剪接形成。一种模型认为pre-RNA的转录过程中由于RNA发生了部分折叠，拉近了原本非相邻的外显子，从而发生了外显子跳跃(exonskipping)，使得被跨越的区域形成了环形RNA中间体，进一步通过套索剪接形成由外显子构成的环形RNA分子。另一种模型认为，位于内含子区域的反向互补序列导致了内含子区域配对介导反向剪接从而形成环形RNA分子。环状RNA(CircRNA)研究技术手册6环状RNA的生物功能有哪些？A、circRNA顺式调控亲本基因的表达。一方面，circRNA可以与RNA结合蛋白相互结合影响亲本基因mRNA的表达。另一方面，环状RNA形成过程中内含子间竞争性互补配对可以与线性RNA之间达成一种平衡，影响mRNA的表达，甚至蛋白翻译。环状RNA的3类可变环化模式环状RNA(CircRNA)研究技术手册7环状RNA调控亲本（parental）基因的3类模式B、环状RNA发挥竞争性内源RNA——ceRNA的作用吸附microRNA2013年，两个研究团队在nature杂志上发文报道，CDR1基因起源的环状RNA（ciRS-7）可以结合吸附miR-7，从而降低miR-7的活性，间接上调miR-7相环状RNA(CircRNA)研究技术手册8关靶基因的表达。由于环状RNA的稳定性，在机体内潜在对microRNA的吸附能力要强于线性的mRNA和lncRNA。circRNA可作为内源microRNAsponge调控microRNA含内含子序列的环状RNA(ciRNA、EIciRNA)一般常驻细胞核内，调节基因的转录。一个典型的案例：来源于ANKRD52基因第二个内含子区域的circRNA环状RNA(CircRNA)研究技术手册9ci-ankrd52依赖于和该基因共同的RNA序列（橙色部分）来避免与内含子索套脱支。ci-ankrd52主要在细胞核中积累，并促进RNAPolII对ANKRD52基因的转录。C、作为疾病的生物标注物？环状RNA有较强的组织表达特异性，研究发现cANRIL是一个从INK4A0ARF反义转录本，cANRIL的表达可能与INK4/ARF的转录和心血管硬化疾病风险相关。另外，研究人员发现has_circ_002059在胃癌中表达下调，是一个潜在的胃癌诊断的biomarker。黄胜林团队对肝癌细胞外泌体circRNA测序发现，circRNA在外泌体中大量富集且于正常细胞相比差异很大，同时血清中肿瘤circRNAs的富集程度甚至与肿瘤的大小有关。表明环状RNA是未来疾病诊断和治疗的潜在靶点。环状RNA(CircRNA)研究技术手册10二、CircularRNA研究工具1.circRNA数据库NameDescriptionLinkReferencesdeepBase包含了大约15万的circRNA基因（人、鼠、果蝇、线虫等），构建了最全面的circRNA的表达图谱！经常无法访问！（坑爹）相互作用网络数据库[1]circBasecircRNA公共数据库，汇集大量已知或未知功能的circRNA数据（RNA-seq数据等）[2]Circ2TraitscircRNA功能数据库，汇集于circRNA相关的疾病及表征形状数据。经常无法访问！（坑爹）[3][1]Li,JH;Liu,S;Zhou,H;Qu,LH;Yang,JH(Jan1,2014).starBasev2.0:decodingmiRNA-ceRNA,miRNA-ncRNAandprotein-RNAinteractionnetworksfromlarge-scaleCLIP-Seqdata..NucleicAcidsResearch42(1):D92–7.doi:10.1093/nar/gkt1248.PMID24297251.[2]Memczak,S;Jens,M;Elefsinioti,A;Torti,F;Krueger,J;Rybak,A;Maier,L;Mackowiak,SD;Gregersen,LH;Munschauer,M;Loewer,A;Ziebold,U;Landthaler,M;Kocks,C;leNoble,F;Rajewsky,N(Mar21,2013).CircularRNAsarealargeclass环状RNA(CircRNA)研究技术手册11ofanimalRNAswithregulatorypotency.Nature495(7441):333–8.Bibcode:2013Natur.495..333M.doi:10.1038/nature11928.PMID23446348.[3]Ghosal,S;Das,S;Sen,R;Basak,P;Chakrabarti,J(2013).Circ2Traits:acomprehensivedatabaseforcircularRNApotentiallyassociatedwithdiseaseandtraits..FrontiersinGenetics4:283.doi:10.3389/fgene.2013.00283.PMC3857533.PMID24339831.2.circRNA引物库与成环验证团队拥有最成熟的circRNA引物设计与circRNA成环验证技术，区分成环与未成环RNA。3.circRNA功能验证必备工具：circRNA环化载体circRNA发挥其功能时，本身需要环状结构。而研究验证circRNA功能时，往往所克隆的circRNA序列无法完成环化，导致circRNA功能验证无法完成。正是由于环化的难以实现，目前大量的circRNA研究工作在完成了circRNA的高通量筛选之后，举步维艰。为解决circRNA环化问题，独立开发了可高效促进circRNA环化的载体技术:HBcirc-EnhancedTM,可极大促进circRNA成环效率，最真实的展现circRNA的环化状态与功能。把HBcirc-EnhancedTM高效环化载体嫁接到多种病毒载体上，覆盖了细胞、组织与动物活体水平。环状RNA病毒包装（超强成环）circRNA载体名称病毒滴度适合的研究对象环状RNA(CircRNA)研究技术手册12病毒包装载体pHBLV-cir环状RNA慢病毒载体＞108PFU/m细胞系，肿瘤细胞，永生化细胞pHBAD-cir环状RNA腺病毒载体＞1010PFU/ml各种细胞系，各种原代细胞；离体组织；动物活体注射pHBAAV-cir环状RNA腺相关病毒（AAV）载体＞1012vg/ml离体组织；动物活体注射（高效特异性，高体内基因转导效率）pHBRV-cir环状RNA逆转录病毒载体＞107PFU/ml髓系/淋系白血病相关细胞，其他免疫类细胞（T，B，NK等）pHBAd-ciR环状RNA腺病毒载体环状RNA(CircRNA)研究技术手册13pHBAd-ciR环状RNA慢病毒载体pHBAd-ciR环状RNA腺相关病毒载体