现代分子生物学要点总结(朱玉贤版)

1现代分子生物学要点总结(朱玉贤版)一、绪论两个经典实验1、肺炎球菌在老鼠体内的毒性实验：先将光滑型致病菌（S型）烧煮杀活性以后、以及活的粗糙型细菌（R型）分别侵染小鼠发现这些细菌自然丧失了治病能力；当他们将经烧煮杀死的S型细菌和活的R型细菌混合再感染小鼠时，实验小鼠每次都死亡。解剖死鼠，发现有大量活的S型细菌。实验表明，死细菌DNA进行了可遗传的转化，从而导致小鼠死亡。2、T2噬菌体感染大肠杆菌：当细菌培养基中分别带有35S或32P标记的氨基酸或核苷酸，子代噬菌体就相应含有35S标记的蛋白质或32P标记的核酸。分别用这些噬菌体感染没有放射性标记的细菌，经过1~2个噬菌体DNA复制周期后进行检测，子代噬菌体中几乎不含带35S标记的蛋白质，但含30%以上的32P标记。说明在噬菌体传代过程中发挥作用的可能是DNA而不是蛋白质。基因的概念：基因是产生一条多肽链或功能RNA分子所必需的全部核苷酸序列。二、染色体与DNA嘌呤嘧啶腺嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶染色体性质：1、分子结构相对稳定；2、能够自我复制，使亲、子代之间保持连续性；3、能指导蛋白质的合成，从而控制生命过程；4、能产生可遗传的变异。组蛋白一般特性：1、进化上极端保守，特别是H3、H4；2、无组织特异性；3、肽链上氨基酸分布的不对称性；4、存在较普遍的修饰作用；5、富含赖氨酸的组蛋白H5非组蛋白：HMG蛋白；DNA结合蛋白；A24非组蛋白真核生物基因组DNA真核细胞基因组最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白2质的非功能蛋白质所隔开。人们把一种生物单倍体基因组DNA的总量称为C值，在真核生物中C值一般是随着生物进化而增加的，高等生物的C值一般大于低等动物，但某些两栖类的C值甚至比哺乳动物还大，这就是著名的C值反常现象。真核细胞DNA序列可被分为3类：不重复序列、中度重复序列、高度重复序列。真核生物基因组的特点：1、真核生物基因组庞大，一般都远大于原核生物的基因组；2、真核基因组存在大量的的重复序列；3、真核基因组的大部分为非编码序列，占整个基因组序列的90%以上，这是真核生物与细菌和病毒之间的最主要的区别；4、真核基因组的转录产物为单顺反之；5、真核基因组是断裂基因，有内含子结构；6、真核基因组存在大量的顺式元件，包括启动子、增强子、沉默子等；7、真核基因组中存在大量的DNA多态性；8、真核基因组具有端粒结构。原核生物基因组的特点：1、结构简练，绝大部分用来编码蛋白质，只有很少一部分控制基因表达的序列不转录；2、存在转录单元，原核生物DNA序列中功能相关的RNA和蛋白质基因，往往丛集在基因组的一个或者几个特定部位，形成功能单位或转录单元，可以被一起转录为含多个mRNA的分子；3、有重叠基因，所谓重叠基因就是同一段DNA携带两种或以上不同的蛋白质的编码信息。DNA的结构DNA又称脱氧核糖核酸，是deoxyribonucleicacid的简称。L=T+W，L指环形DNA分子两条链间交叉的次数，只要不发生断裂，L是一个常量。T为双螺旋的盘绕数，W为超螺旋数。双螺旋DNA的松开导致负超螺旋，而拧紧则导致正超螺旋。双螺旋碱基间距（nm）螺旋直径（nm）每轮碱基数螺旋方向A-DNA0.262.611右B-DNA0.342.010右Z-DNA0.371.812左DNA的复制半保留复制：Semi-conservativereplication；半不连续复制：Semi-discontinuousreplication把生物体的复制单位称为复制子，一个复制子只含一个复制起始点。归纳起来，无论是原核生物还是真核生物，复制起点是固定的，表现为固定的序列，并识别参与复制起始的特殊蛋白质。复制叉移动的方向和速度虽是多种多样的，但以双向等速方式为主。复制的几种主要方式双链DNA的复制大都以半包六复制方式进行的，通过“眼”型、θ型、滚环型或D-环型等以复制叉的形式进行。1、线性DNA双链进行双向复制时，由于已知的DNA聚合酶和RNA聚合酶都只能从5’到3’移动，所以，复制叉呈眼型；2、环状双链DNA复制可分为θ型、滚环型和D-环形几种类型Ⅰ、θ型，大肠杆菌染色体DNA是环状双链DNA，它的复制是典型的θ型复制，从一个起点开始，同时向两个方向进行复制，当两个复制叉相遇时，复制就停止Ⅱ、滚环型，是单向复制的一种特殊方式，在噬菌体中很常见。DNA的合成由对正链原点的专一切割开始，所形成的自由5’端被从双链环中置换出来并为单链DNA结合蛋白所覆盖，3使其3’-OH端在DNA聚合酶的作用下不断延伸Ⅲ、D-环形，也是单向复制的一种特殊方式，双链环在固定点解开进行复制，但两条链的合成是高度不对称的，最初仅以一条母链作为新链合成的模板，迅速合成出互补链，另一条链则称为游离的单链环。原核生物和真核生物DNA复制的特点原核生物DNA复制特点DNA双螺旋的解旋拓扑异构酶（DNAtopoisomerase）：消除解链造成的正超螺旋的堆积，消除阻碍解链继续进行的这种压力，使复制得以延伸。拓扑异构酶Ⅰ，催化DNA链的断裂和重新连接，每次只作用于一条链，不需要辅助因子如ATP等；拓扑异构酶Ⅱ能同时断裂和连接两条DNA链，通常需要辅助因子。DNA解链酶(DNAhelicase)：解开双链DNA（DnaB蛋白：解螺旋酶；DnaA蛋白：辨认复制起始点；DnaC蛋白：辅助DnaB在起始点上结合并打开双链）单链结合蛋白（SSB）：保证被解链酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构DNA复制的引发所有的DNA复制都是从一个固定起点开始的，而且目前所知的DNA聚合酶都只能延长DNA链而不能从头合成DNA链。DNA复制时，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶从RNA引物3’末端开始合成新的DNA链。DNA聚合酶功能DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅱ（修复）DNA聚合酶Ⅲ聚合作用5’→3’有有有外切酶活性5’→3’有无无外切酶活性3’→5’有有有生物学活性10.0515聚合酶Ⅲ部分亚基的功能亚基αεθβ功能聚合活性3’→5’核酸外切酶活性组建核心酶两个β亚基形成滑动夹子，提高酶的持续合成能力真核生物DNA复制的特点真核生物DNA复制与原核生物DNA复制有很多不同，例如，真核生物每条染色体上可以有多个复制起点，而原核生物只有一个复制起点；真核生物DNA的复制只能在分裂期进行，原核细胞在整个细胞周期都能进行；真核生物的染色体在全部完成复制前，各个起点上DNA不能再开始，而在快速生长的原核生物中，复制起点可以连续开始新的DNA复制，表现虽然只有一个复制单元，但却可有多个复制叉。真核生物DNA复制叉的移动速度不到大肠杆菌的1/20，因此，人类DNA中每隔30000~300000个碱基就有一个复制起始点；真核生物DNA聚合酶有15种以上，大肠杆菌中存在的聚合酶有5种DNA复制的调控真核细胞中DNA复制有3个水平的调控：1、细胞生活水平调控，也称限制点调控，决定细胞停留在G1期还是进入S期；2、染色体水平调控；3、复制子水平调控，决定复制的起4始与否。DNA的修复错配修复一旦复制通过复制起点，母链就会在开始DNA合成前的几秒至几分钟内被甲基化，此后只要两条DNA链上碱基配对出现错误，错配系统就会根据“保存母链，修正子链”的原则，找出错误碱基所在的DNA链，并在对应于母链甲基化腺苷酸上游鸟苷酸的5’位置切开子链，合成新的子链片段。切除修复切除修复是DNA损伤最为普遍的方式，主要分为碱基切除修复和核苷酸切除修复重组修复（复制后修复）先从同源DNA母链上将相应核苷酸序列片段移至子链缺口，然后再用新合成的序列补上母链空缺，主要作用是重新启动停滞的复制叉。DNA直接修复DNA直接修复不需要切除碱基或核苷酸，最常见的例子是DNA光解酶把在光下或经外线光照射形成的环丁烷胸腺嘧啶二体及6-4光化物还原成单体的过程。SOS反应细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，细胞为求生存而产生的一种应急措施，当DNA两条链的损伤邻近时，损伤不能被切除修复或重组修复，这时损伤处的DNA出现空缺，再随机加上核苷酸，容易造成突变。DNA的转座DNA的转座或称移位，是由可移位因子介导的遗传物质重排的现象，频率很低。转座子（Tn）是存在于染色体DNA上可自主复制和移位的基本单位，原核生物的转座子包含4类：1、插入序列（IS）；2、类转座子因子；3、复合转座子，两端由IS或类IS构成，带有某些抗药性基因或其他宿主基因，一旦形成复合式转座子，IS序列就不能再单独移动；4、TnA转座子家族，两端为IR，可编码转座酶，解离酶和抗性物质。真核生物中的转座子主要包括转座子和反转座子。玉米细胞内存在自主型和非自主型两类转座子，非自主型转座子单独存在时是稳定的，不能转座，当基因组同时含有属于同一家族的自主型转座子时，它才具备转座功能。转座子可分为复制型和非复制型，转座酶和解离酶分别作用于原始转座子和复制转座子。转座作用的遗传学效应1、引起插入突变；2、产生新的基因；3、产生染色体畸变（DNA重复、缺失或倒位）；4、引起生物进化组蛋白的种类、修饰类型及其生物学意义根据电泳性质可以把组蛋白分为H1、H2A、H2B、H3、H4，这些组蛋白都含有大量赖氨酸和精氨酸。组蛋白的修饰作用包括甲基化，乙酰化，磷酸化以及ADP核糖基化等。一般来说，组蛋白乙酰化能选择地使某些染色质区域的结构从紧密变的松弛，开放某些基因的转录，增5强其表达水平；而组蛋白甲基化即可抑制也可增强基因表达，乙酰化修饰和甲基化修饰往往是相互排斥的。简述DNA聚合酶Ⅰ和Klenow的结构和功能占DNA聚合酶Ⅰ蛋白2/3的C端区域，相对分子质量68000，具有DNA聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性，即可合成也可降解DNA，保证DNA复制的准确性；占DNA聚合酶Ⅰ蛋白1/3的N端区域，相对分子质量35000，具有5’→3’核酸外切酶活性，可做用于双链DNA，又可水解5’端或距5’端几个核苷酸处的磷酸二酯键。DNA聚合酶Ⅰ在DNA直接修复、除去冈崎片段5’端RNA引物方面具有重要作用。Klenow大片段是用蛋白酶水解DNA聚合酶Ⅰ所得的大片段区域，具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性，在基因工程中有广泛应用，主要有：修复反应、制备平末端；标记DNA3’突出末端；双脱氧末端终止法进行DNA序列分析等。三、生物信息的传递（上）RNA转录的基本过程模板识别真核细胞中的模板识别与原核细胞不同，真核生物RNA聚合酶不能直接识别基因的启动子区，需要转录因子的辅助蛋白质按特定的顺序结合于启动子上，RNA聚合酶才能与之相合并形成复杂的前起始复合物（PIC），以保证有效的起始转录。转录起始转录起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生，该过程不需要引物，RNA聚合酶通过启动子的时间代表一个启动子的强弱，时间越短，该基因的转录起始频率越高。转录延伸RNA聚合酶释放σ因子离开启动子后，核心酶沿模板DNA链移动并使新生的RNA链不断延长的过程。一旦聚合酶启动了基因转录，它就会一直移动合成RNA，直到遇到终止信号时才释放新生的RNA链。转录终止RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合体分开，转录泡瓦解。转录机器的主要成分RNA聚合酶RNA聚合酶以DNA双链为模板（若以单链为模板，活性大大降低），以4种核苷三磷酸为底物，并以Mg2+/Mn2+为辅因子，催化RNA链的起始、延伸和终止，不需要任何引物。原核生物RNA聚合酶大肠杆菌RNA聚合酶由两个α亚基、一个β亚基、一个β’亚基、和一个ω亚基组成核心酶，加上一个σ亚基后则成为聚合酶全酶，转录的起始过程需要全酶，由σ因子辨认起始点，延长过程仅需要核心酶催化。β和β’亚基组成了聚合酶的催化中心，β亚基能与模板DNA、新生RNA链以及核苷酸底物相结合；σ亚基的作用是负责模板链的选择和转录的起始，它是酶的别构效应物，使酶专一性识别模板上的启动子。真核生物RNA聚合酶酶定位转录产物与功能对α-鹅膏覃减RNA聚合酶Ⅰ核仁45SrRNA（5SrRNA）