变性高效液相色谱及其在微生物领域的应用

变性高效液相色谱技术及其在微生物领域的应用变性高效液相色谱技术简介发展史和基本原理技术特征和影响因素变性高效液相色谱技术在微生物领域的应用报告内容变性高效液相色谱技术简介概念：变性高效液相色谱法(denaturinghighperformanceliquidchromatography，DHPLC)是在接近DNA解链温度条件下进行的离子对反相色谱分析法。由于主要影响因素为环境温度，因此也称作温度调控异源双链分析法(temperaturemodulatedheteroduplexanalysis，TMHA)或温度调控高效液相色谱法(temperaturemodulatedhighperformanceliquidchromatography，TmHPLC)。最先由美国Stanford大学Oefner及Underhill等在1995年提出，现已有公司生产出商业化的检测仪器。目前全球使用最多也最易操作的是美国Tansgenomic公司开发的WAVE核苷酸片段分析系统。变性高效液相色谱技术简介原理：变性高效液相色谱法也叫温度调控高效液相色谱法，目标核酸片段通过PCR扩增后，将温度升高使DNA片段开始变性,则部分变性的DNA可被较低浓度的乙腈洗脱下来。由于异源双链(错配的)DNA与同源双链DNA的解链特征不同，在相同的部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，被色谱柱保留时间短于同源双链先被洗脱下来，从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线，此即DHPLC检测的基本原理。工作温度(柱温)是决定DHPLC敏感性的最关键因素取样PCR扩增DHPLC分析分析报告电泳分析分析报告PCR-DHPLC的分析流程图PCR产物电泳分析流程图变性高效液相色谱技术简介发展史：1995年美国Stanford大学Oefner及Underhill等提出概念，现已有公司生产出商业化的检测仪器。DHPLC技术的迅速发展得益于新型柱填料的不断出现。目前，应用于DHPLC的色谱柱有以下3类：1）苯乙烯、二乙烯苯单体、引发剂和致孔剂等混合物在石英毛细管内采用原位合成方法制备成的整体柱(monolithiccolumn）。2）使用315μm硅胶表面键合直链硅烷固定相作为填料的ZorbaxEclipsedsDNA分析柱(Agilent公司)。变性高效液相色谱技术简介3）使用2-3μm无孔多苯乙烯-二乙烯基苯（PS/DVB）共聚物微球，表面键合C18固定相作为填料的DNASep分析柱(Transgenomic公司）填料特点：热稳定性好、耐高温的PS/DVB微粒可保证分析结果的准确性和重复性。利用离子对反相液相色谱模式分离核苷酸，实现梯度洗脱条件下双链DNA(dsDNA)片段的尺寸依赖性分离。可以连续进样分析超过6000次，无须再生。目前全球使用最多的是美国Transgenomic公司开发的WAVE核苷酸片段分析系统,它通过一个独特的DNA色谱柱DNASep柱进行核酸片段的分离和分析。DHPLC的优缺点（1）优点DHPLC具有检测效率高，对未知样品的准确率可达95%以上。该技术具有完全自动化、灵敏度高、经济等优点，可以大大节省工作量，降低检测周期，已经在实际工作中得到了广泛应用。（2）缺陷DHPLC检测对所用试剂和环境要求较高，容易产生误差，不能检测出纯合突变。DHPLC的三种工作模式（1）在核酸非变性条件下，即50℃下，能够进行DNA片段大小的分析、分离不同大小DNA的片段、PCR质量监测、LOH、MSI等分析检测，还可以纯化、收集DNA、cDNA片段。2）核酸部分变性条件下，即52~78℃下，可检测单碱基DNA突变和单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphisms，SNP）。3）在双链核酸分子完全变性条件下（78~80℃），可用于对寡核苷酸、单链DNA、RNA的分离、纯化、收集等工作。DHPLC在微生物领域的检测主要在第一种和第二种模式下工作。DHPLC的三种工作模式示意图变性高效液相色谱技术简介DNASep色谱柱的分离机制：DNASep色谱柱填料PS/DVB共聚物微球是疏水电中性的，不与核酸分子发生直接反应。三乙基铵醋酸盐(TEAA)是一种离子对试剂，是疏水性的、带正电荷，既能与核酸主链上的磷酸基团的负电荷反应，同时又与固定相上碳-18链的疏水基团发生反应，使DNA片段吸附在固定相上。变性高效液相色谱技术简介DHPLC分离规律：1）DNA片段越长,结合的TEAA越多,与固定相结合得越牢固,越不易被洗脱；2）大小相同的片段与柱子结合的难易程度也会因其序列不同而不同；3）羟基链与固相结合强度随乙腈浓度的增加而减弱；变性高效液相色谱技术简介DHPLC分析的影响因素（1）PCR产物PCR扩增为DHPLC检测提供标本源，对PCR无特殊要求，但要尽量保证PCR扩增产物的忠实性，避免人为引入错配碱基。（2）洗脱温度温度是影响DHPLC检测成功与否的至关重要因素。WAVE系统中的WAVEMaker软件可根据待分析片段的DNA序列很方便地预测出柱温。斯坦福大学Tm计算网站()提供的Melt软件也可辅助温度选择。变性高效液相色谱技术简介（3）流动相流动相中离子配对剂的TEAA浓度对DHPLC分析的温度有显著影响。如果TEAA的浓度从10mmol/L升高至200mmol/L，那么对应的最佳检测温度就要提高4-4.5℃。流动相的pH值对检测效果几乎没有任何影响，但pH值太高，将会使双链DNA完全变性，达不到检测目的。pH值太低，又会干扰DNA与TEAA的相互作用，影响检测效果。变性高效液相色谱技术简介DHPLC对检测样品要求（1）片段大小适于DHPLC检测变异的PCR产物长度最佳范围在200~500bp。大于500bp的片段敏感性会下降,小于200bp的片段检测难以找到合适的检测温度，易造成漏检。（2）样品含量PCR产物浓度必须足够大,要求浓度至少20ng/Ll(。通常上样需3~10Ll(大约50~200ng)。若样品浓度太低,因为信噪比下降,分析结果的可靠性也会随之下降。变性高效液相色谱技术简介（3）PCR反应试剂DNASep柱精密易损，对常用PCR试剂有一定要求，需要重视。变性高效液相色谱的应用基因变异的检测DNA微卫星鉴定肿瘤杂合性缺失的检测RT2PCR的竞争性定量人种遗传学分析基因作图核酶中自身剪切反应的研究细菌鉴定变性高效液相色谱在微生物领域的应用1、郑秋月，曹继娟，蒋丹等.食品中拟态弧菌变性高效液相色谱检测技术研究，食品科学，2009，30（6）：175~177.（单位：辽宁出入境检验检疫局）应用PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术对食品中致病菌拟态弧菌进行检测，建立快速高通量检测方法，方法有很好的特异性，准确度高，操作快速、简便。文章特点：利用DHPLC在非变性温度下进行双链DNA分离的原理，应用DHPLC技术分析拟态弧菌特异性PCR扩增产物。在优化的分析条件下，对样品洗脱峰排列形成的聚类分析图分析，得到拟态弧菌的特征峰型图谱，结果有很好的特异性。仪器：PE2400PCR仪，DHPLCWaveOptimizedSystemTransgenomic公司。PCR反应体系和条件：以拟态弧菌浓度相同的DNA模板进行PCR反应，微调引物量，选出反应效果最佳的引物浓度。同时进行Taq酶、Mg2+、引物用量和循环条件优化，直至得出最佳反应体系。DHPLC分析条件：检测温度：50℃；洗脱的DNA双链在波长260nm处进行紫外吸收检测；流动相：缓冲溶液A浓度为50.2%，缓冲溶液B浓度为49.8%；流速：0.9ml/min；上样量：PCR产物5μlPCR-DHPLC检测结果琼脂凝胶电泳检测拟态弧菌PCR反应结果，扩增出243bp特异性条带。对拟态弧菌特异性PCR产物进行DHPLC检测，检测图谱如图1所示。共检测了30株拟态弧菌，其特异性PCR产物在50℃非变性条件下，在目标产物处均出现一个单一的洗脱峰，基线平整，滞留时间一致，具有高度同一性。特异性实验灵敏度实验实验结果表明，可检出56CFU/ml的拟态弧菌。实际样品检测对水样、鱼类、虾蟹、贝类等3036份样品检测，同时采用培养法对比。实验结果表明，用PCR-DHPLC方法检出的11份阳性样本，采用经典方法验证，均证实为阳性结果。变性高效液相色谱在微生物领域的应用2、徐君怡，曹继娟，郑秋月等.变性高效液相色谱检测食品中致泻性大肠杆菌，微生物学报，2008，48（11）：1526~1531.（单位：辽宁出入境检验检疫局）分别根据4种致泻性大肠杆菌的特异性毒力因子基因序列设计引物，PCR扩增产物经变性高效液相色谱快速检测。以肠产毒性大肠杆菌等32株试验菌株做特异性检测，4种致泻性大肠杆菌标准菌株进行灵敏度检测。试验结果表明方法特异性好，灵敏度高，该方法可以快速、准确地检测食品中的致泻性大肠杆菌。仪器：PE2400PCR仪，DHPLCWaveOptimizedSystemTransgenomic公司，型号NAV-99-4500。PCR反应体系和条件：以拟态弧菌浓度相同的DNA模板进行PCR反应，微调引物量，选出反应效果最佳的引物浓度。同时进行Taq酶、Mg2+、引物用量和循环条件优化，直至得出最佳反应体系。PCR反应采用25μL体系，优化后的反应条件为94℃3min；94℃60s，60℃60s，72℃60s，35个循环；72℃7min结束反应；4℃保存反应产物。DHPLC分析条件：色谱柱：PS-DVB&C18DNASep色谱柱（4.6mm×50mm，粒度3μm）；柱温：50℃；流动相：缓冲溶液A浓度为50.2%，缓冲溶液B浓度为49.8%；流速：0.9mL/min；检测器：荧光检测器（光源：150WXenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s）；上样量：PCR产物5μL。特异性实验灵敏度实验检测限肠产毒性大肠杆菌27CFU/mL、肠致病性大肠杆菌33CFU/mL、肠出血性大肠杆菌25CFU/mL、肠侵袭性大肠杆菌42CFU/mL。3、郑秋月，傅俊范，徐君怡等.PCR-变性高效液相色谱技术检测食品中产气荚膜梭菌，食品科技，2009，34（5）：277~280.（单位：辽宁出入境检验检疫局）采用DHPLC技术检测产气荚膜梭菌特异性PCR扩增产物，优化分析条件，建立产气荚膜梭菌PCR-DHPLC样品吸收特征峰型图，样本检测的峰型图可用于定性或定量监测食品中产气荚膜梭菌的动态变化。方法特异性强、灵敏度高、快速。变性高效液相色谱在微生物领域的应用仪器：基因扩增仪，美国ABI公司，DHPLCWaveOptimizedSystemTransgenomic公司。PCR反应体系和条件：PCR反应体系(25μL)：10×PCR缓冲液2μL、引物对(10μmol/L)各1μL、dNTPs(10mmol/L)2μL、TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL、模板DNA2μL、水16.8μL。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，进行35个循环；72℃延伸7min，4℃保存反应产物。DHPLC分析条件：色谱柱：PS-DVB&C18DNASep色谱柱(4.6mm×50mm，粒度3μm)；柱温50℃；流动相：缓冲溶液A浓度50.2%，缓冲溶液B浓度49.8%；流速：0.9mL/min；上样量：PCR产物5μL。特异性实验灵敏度实验PCR-DHPLC可检测至产气荚膜梭菌标准菌株的10-6浓度梯度，即检测灵敏度可达167cfu/mL。4、陈茹，毕英佐，刘志玲等.四种重要致病性分枝杆菌DHPLC检测鉴别方法的建立，中国人兽共患病学报，2010，26（1）：41~47.（单位：广东出入境检验检疫局）对结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、禽分枝杆菌以及副结核分枝杆菌建立多重PCR-DHPLC快速同时检测方法。对结核分枝杆菌等51株分枝