SELEX技术详解

SELEX技术冯俊奎Introduction单克隆抗体技术将产生抗体的单个B淋巴细胞同肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产单克隆抗体。单克隆抗体单克隆抗体作为蛋白质，具有特定的空间结构，基于此空间结构其与底物结合具有特异性、多样性和定向性，使其在检验医学、蛋白质的提纯、肿瘤的导向治疗等多领域得到广泛应用。正是由于抗体蛋白结构的多样性和特异性决定了单克隆抗体的广泛应用RNA结构的多样性RNA分子中除G-C、A-U碱基配对外,还有G-U等变偶碱基对的存在,可以形成发夹、假结、凸环、G-四联体等空间结构,即使一段很小的RNA分子也能形成具有相当刚性的稳定结构。IntroductionIntroduction多达1014个以上的随机寡核苷酸几乎涵盖了所有可能的立体构象,基于核酸的三级结构，核酸配体可以高亲和力的结合于从单个小分子到复杂分子再到完整的生物细胞核组织的广泛靶目标。SELEX技术的诞生（1990年）Ellington和Szostak报道了能够特异性结合于染料小分子的RNA配体，并创造了适配体（aptamer）这个名词，以指代核酸配体。Tuerk和Gold描述了针对T4DNA聚合酶适配体的筛选，提出并命名了SELEX技术。SELEXtechnologySystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX即指数富集的配基系统进化技术利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸适体。SELEXtechnology1.SELEX技术主要内容SELEX技术的基本思想是体外化学合成一个单链寡核苷酸库,用它与靶物质混合,形成靶物质—核酸的复合物,洗掉未与靶物质结合的核酸,分离与靶物质结合的核酸,以此核酸分子为模板进行PCR扩增,再进行下轮的循环筛选过程。通过重复的筛选与扩增,最后得到与靶物质具有高亲和力与高特异性的适体。SELEXtechnologySELEXtechnology自1990年以来，SELEX技术所用作的靶物质种类不断增加。2.SELEX的靶物质无机离子Zn2+Ni2+有机小分子乙醇胺茶碱有机染料胆酸等核苷酸类腺嘌呤ATPcAMP黄嘌呤等辅酶因子辅酶A生物素FMNFAD等核酸E.coli5SRNA酵母苯丙氨酸tRNA等氨基酸L-缬氨酸D-色氨酸等糖类几丁质交联葡聚糖等抗生素卡那霉素A、B链霉素等多肽蛋白质类HIV-I整合酶HGF链霉亲和素等复杂结构炭疽孢子核糖体蛋白PC12cell等SELEXtechnologySELEX技术对靶物质的要求SELEX可以用于众多不同的靶物质，让人们不禁想到适配子的选择可能用于所有的物质。事实并非如此，SELEX技术对靶物质也存在一些要求。比如单分子靶物质要求高纯度，以减少非特异性结合，非极性强和不带电的物质筛选困难等。SELEXtechnology3.随机DNA寡聚核苷酸文库的构建SELEX首先根椐分子生物学技术，人工合成单链随机寡核苷酸文库。通常文库容量为1014一1015个单链寡核苷序列。库的两端是固定序列作为PCR扩增引物结合位点，中间为随机序列，随机序列长度在20-80nt。若是筛选RNA，库5’端要加上T7启动子序列和反义引物，使库能翻译为RNA库和反转录用于PCR扩增。SELEXtechnology文库中随机序列的长短影响SELEX筛选的结果，要根据靶物质的大小性质选择合适的随机长度，太长太短都不好。有的研究人员初期合成大量的库，中间重复筛选时不再进行扩增，减少DNA合成时产生的有害产物。人们可以对核酸库进行修饰以探索新的特性、增加库的稳定性或者增加对核酸酶的抗性。SELEXtechnology4.筛选过程筛选过程包括，库与靶物质混合，除去未与靶物质结合的寡核苷酸，洗脱与靶物质结合的寡核苷酸三个步骤。旨在从随机库中筛选出与靶物质高亲和力和特异性结合的寡聚核苷酸。SELEXtechnology如何分离得到与靶物质相结合的寡核苷酸链是筛选过程的关键。4.1硝酸纤维素（NC)法将共育的混合物经NC膜用真空抽吸过滤，与靶分子结合的寡核苷酸序列留在滤膜上，而未结合靶分子的寡核苷酸序列可被滤掉。经洗涤、剪碎滤膜，洗脱、乙醇沉淀等回收结合的寡核苷酸序列。该法操作简单、成本低，无需特殊设备。但不能应用于较小的靶分子，且对有丰富构象的随机寡核苷酸序列有较强的背景吸附。SELEXtechnology4.2亲和柱法靶物质与亲和柱里的琼脂珠进行交叉连接。与靶物质结合的寡核苷酸序列就吸附在琼脂珠上，而未结合的寡核苷酸序列则滤过，再用高盐溶液洗脱结合的寡核苷酸序列，然后进行回收。亲和柱法是一种有效的分离方法，适合于不能用NC膜分离的小分子物质。SELEXtechnology4.3磁珠法将靶物质结合到磁珠上，利用磁珠筛选。分离法需要的靶分子少，能快速高效的分离结合或未结合的寡核苷酸序列，操作更为简单。4.4微孔板法将靶分子固定在微孔板上，用小牛血清封闭其余的位点，然后加入随机寡核苷酸文库共育，之后通过简单洗涤即可除去未结合的寡核苷酸序列，洗脱回收结合的寡核苷酸序列。该法操作简单，成本低。但筛选效率不高。SELEXtechnology4.5凝胶阻滞电泳法凝胶阻滞电泳法主要通过核酸和蛋白质的分子大小和电荷数把结合和未结合蛋白质的核酸分开。但是分离后还要进行切胶回收，不稳定的回收效率常使寡核苷酸序列损失过大。SELEXtechnology4.6毛细管电泳法其原理主要未结合的寡核苷酸序列电泳时的迁移速度比结合的快。毛细管电泳由于分辨率极高，可以高效快速的筛选。毛细管电泳把SELEX筛选由常规的8-12轮减少到2-4轮，其筛选时间由几周减少到几天，有良好前景。但也存在一些缺点，分离量少，不同靶分子的电泳条件也需要优化，而且对不能引起较高的电泳迁移率的靶分子如一些小分子、细胞等的分离效率低下。SELEXtechnology5.扩增在此过程中，筛选出的DNA适配子直接通过PCR扩增。RNA适配子要进行反转录PCR，得到cDNA库，再用作下次筛选。SELEXtechnologySELEXtechnology6.ssDNA分离从PCR产物中分离单链DNA用于下轮筛选。7.分子克隆与表征当筛选循环中已富集寡核苷酸库的亲和力不在增加的时候，一般在6-20个筛选循环后，靶物质独特的适配子就筛选出来了。一般情况下，我们对50个或更多的筛选出来的克隆进行测序和序列分析。将他们详细分类。对这些独特序列二级结构分析，可以得到相关的结构和结合信息。随后展开对靶物质结合亲和力和灵敏度的研究，并最终用于实际应用。SELEXtechnologySELEX的后期修饰既可以增加适配子的稳定性，又可以巩固其与靶物质或相关分子的结合参数。并且为了进一步应用，增加了功能集团的后期修饰适配子可以用于检测和固定靶物质。Post-SELEXmodifications医学和药学的基础研究、临床诊断和治疗，适配子开始与抗体竞争成为治疗剂。适配体相比于抗体在一般条件下更适合肿瘤导向和体内成像。免疫诊断学，基于酶联免疫吸附测定，开发了酶联寡核苷酸分析。用于分析系统的分子检测。在生物传感器方面适配体会成为出色的受体。FieldsofapplicationsofaptamersAdvantages库容量大，适应范围广泛；对靶无限制小，包括未知结构靶物质。高分辨率。能很好的区分靶物质和其类似物。高亲和力。亲和力甚至高于靶物质的天然结合物。相比于抗体的体内筛选，SELEX筛选过程相对简便、快速、经济。Advantagesandlimitations适配子的变性和复性快速、可逆，可重复使用、长期保存和室温运输，相对抗体和其它蛋白分子具有很强的实用性。适配子体积小。作为药物给药时只产生很低的免疫源性，对肿瘤穿透力强，而且体内易清除。可建立自动化SELEX。筛选可进行多种改进满足不同需求。AdvantagesandlimitationsAdvantagesandlimitationslimitations不是所有的物质都适合SELEX筛选。没有一个标准的SELEX流程可用于所有的靶物质。经常在筛选过程中出线明显的非特异性扩增。在生理环境下，适配子不稳定，易降解。相比于抗体，高亲和力的适配体还没有广泛的筛选出来。谢谢。