荧光光谱分析法-课件

122008年诺贝尔化学奖下村修现年80岁的下村修1928年出生于日本京都府，1960年获得名古屋大学理学博士学位后赴美，先后在美国普林斯顿大学、波士顿大学和伍兹霍尔海洋生物实验所工作。他1962年从一种水母中发现了荧光蛋白，被誉为生物发光研究第一人。马丁·沙尔菲马丁·沙尔菲出生于1947年，现年61岁，是美国哥伦比亚大学生物学教授。他获奖的主要贡献在于向人们展示了绿色荧光蛋白作为发光的遗传标签的作用，这一技术被广泛运用于生理学和医学等领域。瑞典皇家科学院8日宣布，美籍华裔科学家钱永健、美国生物学家马丁·沙尔菲和日本有机化学家兼海洋生物学家下村修共同获得2008年度诺贝尔化学奖，将均分1000万瑞典克朗（约合140万美元）奖金。帮助他们获奖的是绿色荧光蛋白。这种蛋白为生物与医学实验带来革命，它发出的荧光像一盏明灯，帮助研究人员照亮生命体在分子层面和细胞层面的诸多反应。由于绿色荧光蛋白用紫外线一照就发出鲜艳绿光，研究人员将绿色荧光蛋白基因插入动物、细菌或其他细胞的遗传信息之中，让其随着这些需要跟踪的细胞复制，可“照亮”不断长大的癌症肿瘤、跟踪阿尔茨海默氏症对大脑造成的损害、观察有害细菌的生长，或是探究老鼠胚胎中的胰腺如何产生分泌胰岛素的β细胞。34用荧光抗体染色之原生动物澳大利亚科学家最新发现，一种叫“螳螂虾”的海里动物通过发出色彩鲜艳的荧光来恐吓警告敌对者或者吸引性配偶，5K.Brejcet.al.,PNAS94(1997)23061nmgreen-fluorescentprotein(GFP)6第五章荧光分析法第一节荧光分析法的基本原理第二节荧光定量分析方法第三节荧光分光光度计7某些物质受到光照射，除吸收某种波长的光之外，发射出比原来所吸收光的波长更长的光——光致发光（二级光）。光致发光√荧光fluorescence磷光phosphorescence荧光分析法是根据物质的荧光谱线的位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的仪器方法。8分子荧光分析的特点：1.灵敏度高：一般紫外一可见分光光度法的检出限约为10-7g/ml，而荧光分析法的检出限可达到10-10甚至10-12g/ml。2.选择性好3.线性范围宽4.应用范围窄9第一节荧光分析法的基本原理1.分子荧光的产生一、分子荧光molecularfluorescence★分子能级比原子能级复杂★在分子体系中，每个电子能级上都存在振动、转动能级★室温下大多数分子处于基态的最低振动能层★在基态时，含有偶数个电子的分子，电子的ms为+1/2和-1/2,s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为基态单重态,用符号S0表示10分子吸收辐射后电子被激发且不发生自旋方向的改变ms为+1/2和-1/2,s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为激发单重态,用符号S表示。（S1S2S3…）电子被激发且伴随着自旋方向的改变ms为+1/2和+1/2,s=1，M=3。则该分子所处的电子能态称为激发三重态,用符号T表示。（T1T2T3…）S011小结：分子能级与跃迁基态(S0)→激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势，发生的几率大；第一、第二、…电子激发单重态S1、S2…；第一、第二、…电子激发三重态T1、T2…；电子能级的多重性M=2S+1平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；12S0→S1、S2允许跃迁；S0→T1、T2禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小；小结：激发单重态与激发三重态的不同√激发单重态分子中没有净电子自旋，因而具有反磁性；激发三重态有2个自旋平行电子，是顺磁性的激发单重态分子平均寿命短（10-8~10-6s），而激发三重态的长（10-4~10s）基态单重态到激发单重态的激发，不涉及电子自旋方向的改变而容易发生，属于允许跃迁；而到激发三重态属于禁阻跃迁S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l4外转换l3T2内转换振动弛豫14激发态→基态的能量传递途径√电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；荧光延迟荧光磷光辐射跃迁无辐射跃迁传递途径内转移外转移系间跨越振动弛豫荧光：10-7～10-9s，第一激发单重态的最低振动能级→基态磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态15辐射和非辐射能量传递过程√振动弛豫：同一电子能级中，以热能量交换形式由高振动能层至低相邻振动能层间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s内转换：相同多重态的电子能级间的等能级的无辐射跃迁。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。发生内转换的时间10-13s。荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能层→基态(荧光多为S1→S0跃迁)，发射波长为l3的荧光，10-7~10-9s。发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长：l3l2l1；系间跨越：激发态的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的非辐射跃迁。禁阻跃迁，但当能层有较大重叠时S1T1就可发生系间跨越，通过自旋—轨道耦合进行。10-6s外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质分子之间碰撞引起的转移能量的非辐射跃迁。常发生在S1或T1S0外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态(T1→S0跃迁)；发光速度很慢：10-4~100s、磷光的能量比荧光小电子由S0进入T1的过程：（S0→T1禁阻跃迁）S0→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→T1光照停止后，可持续一段时间172.荧光的激发光谱与荧光光谱excitationspectrumandfluorescencespectrum（1）荧光的激发光谱激发光谱：表示不同激发波长下所引起物质发射某一波长荧光的相对效率。绘制激发光谱：固定发射波长(选最大发射波长),然后以不同波长的入射光激发荧光物质，以荧光强度F对激发波长l作图，即为激发光谱。荧光分子都具有两个特征光谱：激发光谱和发射光谱（荧光光谱）√。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大，称为最大激发波长lex（2）荧光的发射光谱（荧光光谱）荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。绘制发射光谱时，使激发光波长固定在lex处，然后对发射光谱扫描，测定各种波长下相应的荧光强度，以荧光强度F对发射波长l作图，得发射光谱图（即荧光光谱）。发射光谱（荧光光谱）的位置？磷光光谱的位置？200260320380440500560620荧光激发光谱荧光发射光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱20激发光谱与发射光谱的关系√a.Stokes位移荧光光谱总是位于物质激发光谱的长波一侧，即荧光波长大于激发光波长的现象。激发光谱与发射光谱之间的波长差值：振动弛豫、外转换等无辐射跃迁损失了部分能量。b.荧光光谱的形状与激发波长无关电子可以跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图l2、l1)，产生不同吸收带，但荧光光谱却只有一个发射态，如l3。为什么？21c.镜像规则由于电子基态的振动能级分布与激发态相似，故通常荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。各小峰波长递减值与振动能级差有关，各小峰的高度与跃迁几率有关。基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的某振动能级若跃迁到第一激发态的某振动能级的几率较大的话，相反跃迁也如此。23二、荧光的产生与分子结构的关系relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（）：吸收的光量子数发射的光量子数物质的荧光量子产率范围一般是多少?如果一个分子将吸收的光子全部释放，则其量子产率为100%。242.有机化合物的分子结构与荧光的关系√（1）跃迁类型：*→的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（4）取代基效应：芳环上有供电子基，使荧光增强。（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。2526√三、影响荧光强度的因素relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure影响荧光强度的外部因素1.溶剂的影响同一物质在不同溶剂中，其荧光光谱的形状和强度都有差别。一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增大而长移，荧光强度也有所增强。这是因为在极性溶剂中，ππ*跃迁所需的能量差△E小，而且跃迁几率增加，从而使紫外吸收波长和荧光波长均长移，强度也增强。溶剂粘度减小时，可以增加分子间碰撞机会，使无辐射跃迁增加而荧光减弱。故荧光强度随溶剂粘度的减小而减弱。由于温度对溶剂的粘度有影响，一般是温度上升，溶剂粘度变小，因此温度上升，荧光强度下降。272.温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，分子运动速度加快，分子间碰撞的几率增加，外转换去活的几率增加，荧光效率降低。例如荧光素钠的乙醇溶液，在0℃以下，温度每降低10℃，f增加3％，在80℃时，f为1。28当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH值对该荧光物质的荧光强度有较大影响，这主要是因为在不同酸度中分子和离子间的平衡改变，离子结构发生变化，因此荧光强度也有差异。每一种荧光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式，也就是有它最适宜的pH值范围。例如苯胺在不同pH值下有下列平衡关系：苯胺在pH7～12的溶液中主要以分子形式存在，由于NH2为提高荧光效率的取代基，故苯胺分子会发生蓝色荧光。但在pH2和pH＞13的溶液中均以苯胺离子形式存在，故不能发射荧光。3.溶液pH对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；294.内滤光作用和自吸现象自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；305.荧光熄灭剂荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂(quenchingmedium)。如卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。316、散射光小部分光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射。瑞利光：光子和物质发生弹性碰撞，不发生能量交换，只是光子运动方向发生改变。其波长与入射光波长相同。拉曼光：√光子和物质发生弹性碰撞，发生能量交换，光子把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量。从而发射出比入射光稍长或稍短的光。散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长的拉曼光，与荧光波长接近，对测定的干扰大，必须采取措施消除。拉曼光的干扰主要来自溶剂，当溶剂的拉曼光与被测物质的荧光光谱相重叠时，应更换溶剂或改变激发光波长32选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰a:320nm或350nm为激发光，荧光峰总是在448nm。b:将空白溶剂分别在320nm及350nm激发光照射下测定荧光，激发光波长为320nm时，拉曼光波长是360nm，360nm的拉曼光对荧光无影响；当激发光波长为350nm时，拉曼光波长是400nm，400nm的拉曼光对荧光有干扰，因而影响测定结果。硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱33四、荧光试剂荧光试剂是一种可以使非荧光物质或弱荧光物质与其反应之后，得到强荧光性产物的标记物，从而可扩大荧光分析法的使用范围1.有机化合物的荧光分析脂肪族化合物能产生荧光的为数不多。芳香族及具有芳香结构的化合物，因存在共轭体系而容易吸收光能，在紫外光照射下很多能发射荧光。有时为了提高测定的灵敏度和选