酶动力学引论

第五章酶动力学引论底物浓度酶浓度pH温度激活剂抑制剂主要内容——研究各因素对酶催化反应速度的影响1.底物浓度对酶催化反应速度的影响酶催化应速度与底物浓度的关系p203酶催化反应进程曲线051015050100150200250300水解时间(min)DH(%)537酸性蛋白酶，50℃，pH3,E/S=4%（酶与底物的浓度之比）AS1398中性蛋白酶50℃，pH7,E/S=2%胰蛋白酶37℃，pH8,E/S=4%胰酶37℃，pH8,E/S=4%Alcalase60℃,pH8,E/S=12AU(安森单位)/Kg木瓜蛋白酶，60℃,pH5,E/S=10%Protamex50℃,pH6.5,E/S=24AU/Kg一底物或其他底物浓度不变时适用反应出现平衡的原因05101520250100200300水解时间（min）水解度DH%E+SESE+P1+P2Notep2米氏方程V=Vmax[S]/(Km+[S])V=Kcat[E]t[S]/(Km+[S])Kcat:催化常数（酶的转化数）每秒种每个酶分子转换底物的微摩尔数Kcat/Km:专一性常数Km,Kcat,andkcat/Km米氏方程的意义米氏常数为反应速度是最大反应速度一半时的底物浓度，Km单位为摩尔浓度（mol/L）Km对于特定的反应条件而言是一个特征常数。它只与酶的性质有关而与酶的浓度无关，不同的酶，具有不同的Km值。Km值作为常数只是对固定的底物、一定的温度、一定的pH等条件而言的。Km值可以反映酶同底物的亲和力。Km在实际应用中的作用鉴定酶判断酶的最适底物计算一定反应速度下的底物浓度了解酶的底物在体内具有的浓度水平判断反应方向或趋势判断抑制类型是否复合MM方程Notepart2-10某酶促反应遵从Michaelis-Menten动力学，酶的Km为2.4×10-4mol/L，当底物浓度为0.05mol/L时，其反应速度为128mol毫升-1分钟-1，若底物浓度为10-4mol/L后，其反应速度为多少？如果一酶促反应[S]=0.5Km，则V值等于多少Vmax?米氏方程的求法Lineweaver-BurkplotAnEadie-Hofsteeplotv=-Km(v/[S])+VmaxRandomsubstratebinding（随机机制）Orderedsubstratebinding（有序机制）双底物反应的反应机理N12Theping-pongmechanismeg.chymotrypsinEnzymekineticsexperiment2.酶浓度对酶催化反应速度的影响酶浓度反应初速度条件：无干扰因素存在，[S]Km应用：酶活力测定（在一定时间内产物的数量与酶浓度呈正比）S：8%，pH9，T=60℃05101520050100150200250300水解时间(min)DH(%)E/S=12AU/KgE/S=24AU/Kg添加不同量的Alcalase水解丝素的酶解进程曲线pH对酶催化反应的影响•影响酶的稳定性•影响酶与底物的结合以及酶催化底物转变成产物Notep19-21环境酸碱度影响蛋白质的净电荷JuangRH(2004)BCbasics+NetChargeofaProteinBufferpHIsoelectricpoint,pI-3456789100-影响酶的pH稳定性因素温度是否存在辅助因子或其它小分子有关（Ca+）缓冲剂的种类和浓度底物存在与否介质的离子强度介电常数pH对酶的辅助因子或活化剂稳定性的影响温度辅助因子猪胰-淀粉酶（含钙与否）的pH稳定性酶在250C不同pH值保温20小时，然后在最适pH和含钙条件下测定活力酶的pH稳定性的实验测定在不同的试管中加入同一种缓冲液，它们具有相同体积但不同的pH将试管置于恒温水浴中平衡在各个试管中加入相同体积的待测定的酶液在同一个pH和温度下测定酶的残存活力，这个pH不一定是酶的最适pH，但是酶在此pH下必须是稳定的根据上述实验步骤所得数据，作酶的百分残存活力的对数-保温时间图若仅测定一个保温时间后的残存酶活力，可仅作百分残存活力-pH图酶在不同pH下保温时的失活速度pH对酶催化反应速度的影响pH对酶的活性部位中心质子移变基团的离子化状态的影响pH对底物离子化状态和反应的平衡位置质子供体质子受体pKa--COOHCOO-3.96(Asp)4.32(Glu)--N+H3-NH210.8-SH-S-8.3312.486.00NHCN+H2NH2NHCNHNH2N+HNHHNN参与酶催化的质子移变基团pH对Chymotrypsin活性的影响567891011pH相对活性Chymotrypsin活性区的电子接力Ser195His57Asp102H–O–CH2OC–O-=ActiveSerH–NNCCCHHCH2Ser195His57Asp102-O–CH2OC–O–H=NN–HCCCHHCH2Histidine上的imidazole基团H–NNCCCHHH+pH6pH7+H–NN–HCCCHHInactive+Ser195His57Asp102H–O–CH2OC–O-=H–NN–HCC-HCCH2HChymotrypsin切出新的Ile16N-端I16L13Y146Asp194–CH2COO-Ile16NH2–Ile16+NH3–567891011pH相对活性pH9pH10pKaNewNH2-terminusChymotrypsin要先經裂解後才有活性245R15-I16Chymotrypsinogen(inactive)p-Chymotrypsin(active)S14-R15T147-N148Trypsin-Chymotrypsinogen(active)p-ChymotrypsinI16L13A149Y146Disulfidebonds新的Ile16N-端可稳定Asp194Asp102His57Ser195Asp194Gly193Ile16+NH3CatalyticTriad酶的最适pH一般地说，一种酶仅在一个狭窄的pH范围内才具有最高的活力。其他实验参数：反应的时间、温度、底物的性质及浓度、缓冲液的性质及浓度、介质的离子强度和酶制剂的纯度等。EnzymepHOptimumLipase(pancreas)8.0Lipase(stomach)4.0-5.0Lipase(castoroil)4.7Pepsin1.5-1.6Trypsin7.8-8.7Urease7.0Invertase4.5Maltase6.1-6.8Amylase(pancreas)6.7-7.0Amylase(malt)4.6-5.2Catalase7.0同一种酶作用于不同底物时的最适pH存在差异蛋白最适pH酪蛋白6~8明胶5丝素5Papain(木瓜蛋白酶)蛋白最适pH大豆蛋白、酪蛋白7~9肉糜6.3丝素？Alcalase丝素浓度S=8%，E/S=12AU/Kg,T55℃0246810121416180100200300水解时间(min)DH(%)pH7.5pH8pH8.5pH9pH9.5Alcalase在不同pH值下水解丝素的进程曲线最适pH的确定低温保藏高温处理：灭酶温度对酶催化反应速度的影响•影响酶的稳定性•影响酶反应的速度Notep28温度对酶稳定性的影响•酶分子的大小和结构•pH•离子强度•酶和体系中蛋白质的浓度•保温时间•活化剂和抑制剂温度对酶稳定性的测定先将酶液（不含底物）在不同的温度下保温，而其他条件保持相同在不同的时间间隔，依次取出一定量的酶液置于冰浴中保存，或直接加入到含有底物的反应混合物中在相同的pH和温度下（酶在此条件下是稳定的）测定残存酶活力（只能测定酶的不可逆变性；未考虑底物可能对酶稳定性的影响）温度对反应速度的影响定量表示Q10=(速度）t+10/(速度)t大多数酶催化反应Q10的范围为2－3Arrhenius方程式EnzymeOptimumtemperature(oC)Trypsin37Pectinase50-55Alcalase55-60蛋白最适温度（℃）大豆蛋白55丝素？Alcalase：55~60℃举例丝素浓度S为8%，E/S=12AU/Kg，pH9051015200100200300水解时间(min)DH(%)65℃60℃55℃50℃45℃Alcalase在不同温度下水解丝素的进程曲线最适温度的确定EnzymeexperimentofcatalaseEnzymeInhibitionReversibleInhibitionCompetitiveinhibitionNoncompetitiveinhibitionIrreversibleInhibitionO(CH3)2CH–O–P–O–CH(CH3)2F=ChymotrypsinSer195被DIFP抑制Diisopropyl-fluorophosphate(DIFP)O-…HCH2Ser195O(CH3)2CH–O–P–O–CH(CH3)2=OCH2Ser195X添加底物可抵抗酶竞争性抑制剂Reactiontime酶活被抑制程度(%)100500不加底物添加基質S+DIFP+DIFP&substrateX五、抑制剂对反应速度的影响酶的抑制剂（inhibitor）：凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质1、不可逆性抑制：（irreversibleinhibition）抑制剂与酶的必需基团以牢固的共价键结合，从而使酶活丧失，不能用透析、超滤等去除抑制剂。如低浓度的重金属离子Hg2+、Ag+、As3+可与酶分子SH结合，使酶活抑制。AsCHClClCHCl+ESHSHESSAsCHCHCl+HCl2路易士气巯基酶失活的酶ESHSH++2+HgESSHgH+2重金属盐引起的巯基酶中毒可用二巯基丙醇（BAL）解毒。+ESSAsCHCHCl+CH2SHCHSHCH2OHESHSHCH2SCHSCH2OHAsCHCHClBAL农药敌百虫、敌敌畏、1059等有机磷化合物能特异地与胆碱酯酶（Cholineesterase）活性中心丝氨酸残基的羟基结合，使酶失活。++ROPOOXR'HOEROPOOOR'XHX有机磷化合物羟基酶失活的酶ROPOOCHR'CCl3OHROPOOOR'CHCCl2敌百虫敌敌畏ROPOOXR'有机磷杀虫剂+(CH3)3N+CH2CH2OCOCH3(CH3)3N+CH2CH2OH+CH3COOHH2O胆碱乙酰化酶胆碱酯酶胆碱乙酰胆碱乙酰胆碱为生物体内传递神经冲动的重要物质。胆碱酯酶为羟基酶，有机磷杀虫剂中毒时，此酶活受抑制，结果造成乙酰胆碱的堆积，造成神经过度兴奋直至抽搐而死。可用解磷定来治疗。NCH3CHNOH可逆性抑制1、竞争性抑制特点:抑制剂与底物结构相似.抑制剂与底物结合在酶的同一位点抑制作用可被高浓度的底物减低以至消除.Km增大,Vmax不变.[EI][E][I]=K4K5Ki=K5K4EII+K3K2K1E+SESE+PV=Vmax[S](1+[I]/Ki)Km+[S]1/V1/[S]1/Vmax-1/Km(1+[I]/Ki)竞争性抑制无抑制剂抑制剂斜率=[Km/Vm](1+[I]/Ki)CH2COOHCH2COOH+FADCHCOOHHCCOOH+FADH2¸琥珀酸脱氢酶琥珀酸延胡索酸COOHCH2COOHCOCOOHCH2COOHCOOHCH2CHOHCOOH丙二酸苹果酸草酰乙酸丙二酸、苹果酸、草酰乙酸为琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。GluPABA（对氨基苯甲酸）喋呤HHNHCHCH2COOHCH2COOHNNNNCH2NHCOOHH2NSO2NHRH2N磺胺药PABA+二氢喋呤+GluFH2合成酶FH2FH4磺胺药与PABA结构相似，可与PABA竞争FH2合成酶的活性中心FH2合成受抑制，FH4随之减少，使核酸合成障碍，细菌生长繁殖受到抑制。而人体可直接吸收叶酸。FH2还原酶NNNNCH2NCOH2NH2NCH3NHCHCH2COOHCH2CO