第四章-非水相催化

非水相酶催化反应EnzymaticReactionsinNon-aqueousMedia非水相催化第一节非水介质中的酶促反应概述第二节非水相生物催化介质系统第二节非水介质中酶促反应的条件第三节非水介质对酶性质的影响第四节非水介质中酶促反应应用举例第一节有机介质中的酶促反应概述非水相生物催化的历史非水介质酶催化的研究内容有机相酶反应的优点有机相酶反应具备条件非水相生物催化的历史20世纪60年代发现有几种酶在有机溶剂中仍具有活性。1984年，A.M.Klibanov在Science上发表“EnzymaticCatalysisinOrganicMediaat100℃”，使原来认为生物催化必须在水溶液中进行的酶学概念发生了革命性的变化。非水相生物催化的历史早期发表的关于非水相酶催化的论文•Hill,A.C.(1898)J.Chem.Soc.73,634–658•Kastle,J.C.andLoevenhart,A.S.(1900)Am.Chem.J.24,491–525•Sym,E.A.(1933)Biochem.Z.258,304–324•Sym,E.A.(1936)Enzymologia1,156–160近代非水相酶催化研究再次起飞的里程碑•Zaks,A.andKlibanov,A.M.(1984)Science224,1249–1251•Zaks,A.andKlibanov,A.M.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82,3192–3196非水介质酶催化的研究内容基本理论的研究，包括影响非水介质中酶催化的主要因素以及非水介质中酶学性质通过非水介质中结构和功能的研究，阐明非水介质中酶的催化机制，建立完善基本理论利用上述理论指导非水介质中酶催化反应的应用有机相酶反应的优点：1．有利于疏水性底物的反应2．可提高酶的热稳定性3．能催化在水中不能进行的反应4．可改变反应平衡移动方向5．可控制底物专一性有机相酶反应的优点：6．可防止由水引起的副反应7．可扩大反应pH值的适应性8．酶易于实现固定化9．酶和产物易于回收10．可避免微生物污染三.研究热点仿水溶剂和印迹技术（1）仿水溶剂体系（2）分子印迹技术（1）仿水溶剂体系思路：水在酶催化反应中的作用（具有高介电常数和形成氢键的能力）结论：有机溶剂可以替代部分水（1）仿水溶剂体系概念可用二甲基甲酰胺（DMF），乙二醇，丙三醇等极性添加剂部分或全部替代系统中的辅助溶剂水，从而影响酶的活性和立体选择性。称为仿水溶剂体系。极性添加剂对体系的影响a.对反应体系内水的分配影响b.与蛋白质的直接作用c.对产物分配的影响结论：作为辅助溶剂应该具有高介电常数和多点形成氢键的能力。有机相生物印迹酶枯草杆菌蛋白酶溶液含N-Ac-Tyr-NH2冻干除去抑制剂枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶溶液不含N-Ac-Tyr-NH2冻干枯草杆菌蛋白酶（1）（2）在辛烷中催化酯化反应的速度比较：反应（1）中得到的酶比反应（2）中得到的酶高100倍在水溶液中其活性：相同有机相生物印迹酶概念：酶在含有其配体的缓冲液中，肽链与配体之间的氢键等相互作用使酶的构象改变，这种新构象除去配体后在无水有机溶剂中仍可保持，并且酶通过氢键能特异地结合该配体，这种方法叫生物印迹。利用酶与配体的相互作用，诱导、改变酶的构象，制备具有结合该配体及其类似物能力的新酶称为生物印迹酶有机相生物印迹酶为什么在有机相中会产生印迹现象？水刚性有机相生物印迹酶水在酶催化反应中的作用水直接或间接参与了酶天然构象中所有的非共价相互作用水充当了酶结构的“润滑剂”，使酶分子的柔性增强有机相生物印迹酶有机相中刚性增强原因？四．有机相酶反应具备条件1．保证必需水含量。2．选择合适的酶及酶形式。3．选择合适的溶剂及反应体系。4．选择合适pH值。有机相酶反应具备条件1．保证必需水含量。2．选择合适的酶及酶形式。3．选择合适的溶剂及反应体系。4．选择最佳pH值。第一节结束优点具备条件有利于疏水性底物的反应可提高酶的热稳定性，提高反应温度加速反应能催化在水中不能进行的反应可改变反应平衡移动方向可控制底物专一性可防止由水引起的副反应可扩大反应pH值的适应性酶易于实现固定化酶和产物易于回收可避免微生物污染保证必需水含量合适的酶及酶形式合适的溶剂及反应体系最佳pH值第二节典型的非水相生物催化介质系统水是酶促反应最常用的反应介质。但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多有机化合物(底物)在水介质中难溶或不溶。由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应的发生。是否存在非水介质能保证酶催化？？1984年，克利巴诺夫（Klibanov）等人在有机介质中进行了酶催化反应的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应。第二节典型的非水相生物催化介质系统1.水或缓冲溶液系统；2.水-有机溶剂单相系统；3.水-有机溶剂两相系统;4.乳状液或微乳液系统5.微水有机溶剂单相系统;6.超临界流体系统；7.离子液体介质系统；8.雾点系统;9.无溶剂反应系统1.单一的水或缓冲溶液系统􀂾由于酶的构象与其离子化状态密切相关，因此酶的体外实验研究通常在一定浓度的缓冲溶液体系中进行，这样可保证酶在最佳pH附近发挥最大的活力。􀂾缓冲溶液的种类很多，在酶催化中使用最多的可能是磷酸盐和Tris-HCl，因为大多数酶的最佳pH在中性范围内(pH5~9)，但也有例外的情况。􀂾如果酶的最适pH在中性范围，且反应过程中不涉及pH的变化，那么也可以不用缓冲溶液，直接在水中进行酶催化。例如，Furstoss等首次报道了在普通水中用环氧水解酶成功地制备了(S)-2-吡啶环氧乙烷。发现假丝酵母脂肪酶在催化酮基布洛芬氯乙酯水解时，最大活力在pH4.0附近。更为有趣的是，酶的对映选择率(E值)在pH4.0以下迅速升高，在pH2.2时为13.6，比pH7.0时(E=1.2)提高了一个数量级。1.单一的水或缓冲溶液系统2.水-有机溶剂单相系统􀂾增加亲脂性底物溶解度的一个最简单办法是向反应混合物中加入与水互溶的有机溶剂，通常被称为有机助溶剂或共溶剂(Organiccosolvent)。􀂾常用的助溶剂有二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)、二噁烷(dioxane)、丙酮和低碳醇(如t-BuOH)等。􀂾􀂾由于形成的是均相系统，因此通常不会发生传质阻碍。一般来讲，该系统中与水互溶有机溶剂的量可达总体积的10%~20%(体积分数)，在一些特殊的条件下，甚至可高达90%以上。有些酶(如酯酶和蛋白酶)在水-有机溶剂均相系统中的反应选择性会增加。如果该系统中有机溶剂的比例高过某一阈值，将夺去酶分子表面的结构水，使酶失活2.水-有机溶剂单相系统也有少数稳定性很高的酶，如南极假丝酵母脂肪酶(CALB)，只要在水互溶有机溶剂中有极少量的水，就能保持它们的催化活性。􀂾此外，当酶催化反应在0℃以下进行时，与水互溶的有机溶剂还能降低反应系统的冰点温度，这是低温酶学研究的内容之一。2.水-有机溶剂单相系统应用举例：通过适当地添加少量的DMF（二甲基酰胺），脂肪酶催化布洛芬与正丁醇酯化反应产物的得率从51%提高到91%，且反应活性也有所提高。3.水-有机溶剂两相系统水-有机溶剂两相系统是指由水相和非极性有机溶剂相(烃、醚、酯等)组成的非均相反应系统;体积比可以在很宽的范围内变动。底物和产物则主要溶于有机相中;酶溶解于水相中，这样可使酶与有机溶剂在空间上相分离，以保证酶处在有利的水环境中，而不直接与有机溶剂相接触。3.水-有机溶剂两相系统在两相系统中，分配系数(热力学参数)和质量传递系数(动力学参数)决定了酶反应的拟一级速率常数kcat(=Vmax/KM)。因此整个反应的速率主要由这两个因素(溶解度、搅拌速度等)所决定，而与酶的催化能力关系不大。值得注意的是增加搅拌可以增加质量传递以提高酶催化反应的速度，但不正确的搅拌会产生机械和化学张力而导致酶的失活。通过选择适当的有机溶剂以及适度的水相调节(如pH、盐浓度等)可以控制反应物在两相中的分配。如果在均相系统中存在严重的底物或产物抑制，那么使用两相系统可望在很大程度上缓解这一问题。3.水-有机溶剂两相系统4.乳状液与微乳液系统􀂾在一些疏水性底物的生物转化反应中，还经常使用表面活性剂稳定的乳状液系统。􀂾例如，在脂肪酶催化拆分酮基布洛芬酯的水解反应中，发现添加适量的非离子表面活性剂Tween-80，不但有助于难溶底物酯的分散，使酶反应的速度提高了13倍，而且酶反应的对映选择性也大幅度提高，最多可提高两个数量级。􀂾类似地，在环氧水解酶催化的反应中，也发现添加乳化剂Tween-80要比添加助溶剂DMSO效果要好，不仅改善了酶的活性和选择性，而且提高了酶的稳定性。4.乳状液与微乳液系统原理：形成反胶束系统，水分子聚集在反胶束内核中形成“微水池”，里面容纳了酶分子，这样酶被限制在含水的微环境中，而底物和产物可以自由进出胶束。优点：①组成的灵活性；②热力学稳定性和光学透明性；③逆胶束有非常高的比界面积；④逆胶束的相特性随温度而变化。4.乳状液与微乳液系统A.概念--反胶束体系反胶束体系：是表面活性剂分散于连续有机相中自发形成的纳米尺度的一种聚集体。反胶束溶液是透明的热力学稳定的系统。概念--表面活性剂表面活性剂：表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子。在有机相酶反应中用得最多的是阴离子表面活性剂：AOT(AerosolOT)，其化学名为丁二酸-2-乙基酯磺酸钠。概念临胶束浓度临胶束浓度：是胶束形成时所需表面活性剂的最低浓度，用CMC来表示。CMC的数值可通过测定各种物理性质的突变（如表面张力、渗透压等）来确定。概念--微团正常微团：极性头部向外，与水结合；疏水尾部向内，形成一个非极性的核心。反向微团：疏水尾部向外，与非极性的有机溶剂接触；极性头部向内，形成一个极性核。B.反胶束体系的制备将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度（CMC），便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体则为反胶束。反胶束体系的制备影响因素反胶束的尺寸和形状随表面活性剂-溶剂系统的变化而变化，同时也受温度、压力、离子强度的影响。反胶束体系中的含水量反胶束的大小取决于反胶束的含水量Wo。Wo的定义为反胶束中水分子数与表面活性剂分子数之比，也即有机溶剂中水的摩尔浓度与表面活性剂的摩尔浓度之比。C．基本原理：“水壳”模型反胶束系统中的水通常可分为结合水和自由水。结合水是指位于反胶束内部形成水池的那部分水；自由水即为存在于水相中的那部分水。“水壳”模型水壳模型很好地解释了蛋白质在反胶束内的状况，其间接证据较多。1.从弹性光散射的研究证实在蛋白质分子周围至少存在一个单分子的水层。2.α-糜蛋白酶在反胶束中的荧光特性与在主体水中的特性很相象。3.反胶束中酶显示的动力学特性接近于在主体水中的特性。D．影响的主要因素水相pH值离子强度:主要是由离子对表面电荷的屏蔽作用所决定表面活性剂浓度的影响离子种类对萃取的影响5.微水有机溶剂单相系统均相的有机溶剂体系是指用与水不互溶的有机溶剂取代所有的溶剂水(＞98%)，形成固相酶分散在有机溶剂中的非均相反应体系。处于这种体系中的酶，其表面必须有残余的结构水，才能保证其催化活性。一般有机溶剂中含有小于2%的微量水。常用的与水不互溶的有机溶剂有烃类、醚、芳香族化合物、卤代烃等，它们的疏水指数(logP)较大。固相酶在有机溶剂中具有催化活性是酶的一项重要特性，在过去二十多年的研究中，已证明这种体系是可行、可靠和多用途的。5.微水有机溶剂单相系统固相酶在结构上仍是柔性的，酶分子内部的柔性足以保证酶和底物结合时酶