生物化学知识点总结

第一章氨基酸与多肽化学一、氨基酸氨基酸是蛋白质水解的最终产物，是组成蛋白质的基本单位（构件分子）。1、结构除脯氨酸外，其他均具有如下结构通式除了甘氨酸外，其他均具有不对称碳原子，具有旋光性。2、分类（1）根据R基团化学结构分类1）脂肪族Ⅰ.侧链只是烃链Ⅱ.侧链含有羟基Ⅲ.侧链含硫原子Ⅳ.侧链含有羧基或酰胺基Ⅴ.侧链含有碱性基团2）芳香族3）杂环（2）根据R基团极性分类1）非极性：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Met、Trp2）极性：Thr、Ser、Tyr、Cys、Asn、Gln①带负电荷：Asp、Glu②带正电荷：Lys、Arg、His（3）根据酸碱性质分类1）中性（一氨基一羧基）2）碱性（二氨基一羧基）Lys、Arg、His3）酸性（一氨基二羧基）Glu、Asp（4）根据营养学分类1）必需Met、Trp、Lys、Val、Ile、Leu、Phe、Thr2）非必需（5）不常见蛋白质氨基酸：在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，这些氨基酸都是在蛋白质合成后由相应的基本氨基酸衍生而来。如羟脯氨酸、羟赖氨酸、γ-羧基谷氨酸、N-甲基甘氨酸、磷酸丝氨酸非蛋白质氨基酸：存在于生物体内，但不组成蛋白质的呈游离或结合态的氨基酸，约150种，具有多种生理功能。如β-丙氨酸、高丝氨酸、γ-氨基丁酸、L-瓜氨酸、L-鸟氨酸、牛磺酸。3、性质（1）氨基酸的构型和紫外光吸收Trp、Tyr和Phe对紫外光有一定的吸收，因为分子中含有苯环，这三个氨基酸的光吸收都在280nm附近。可以采用紫外分光光度计在280nm波长处测定最大吸收来测定蛋白质的含量。（2）氨基酸的两性解离及等电点等电点PI：在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性，在电场中既不向阳极也不向阴极移动。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。特点：净电荷数等于零，在电场中不移动；此时氨基酸的溶解度最小等电点的确定：等于两性离子两侧pK值的算术平均数（3）化学反应1）与HNO2的反应2）与茚三酮的反应脯氨酸产生黄色物质，其它为蓝紫色。在570nm（蓝紫色）或440nm（黄色）定量测定（0.5-50μg/ml）。3）与甲醛反应：氨基酸的甲醛滴定法4)与2,4-二硝基氟苯（DNFB）的颜色反应鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸。首先由Sanger应用确定了胰岛素的一级结构，又称为Sanger降解法。5）与苯异硫氰酸酯（PITC）的反应用于N末端分析，由Edman于1950年首先提出，又称Edman降解法。6）半胱氨酸的氧化与还原反应4、氨基酸的分离纯化（1）纸层析原理：组成层析系统的固定相和流动相具有相反的极性。固定相为滤纸上的结合水(极性),流动相为展层液（非极性有机溶剂）。被分析的样品中的各组分与固定相亲和力大者，易留滞于原地，与流动相亲和力大者，易随流动相移动，因而达到分离的目的。（2）薄层层析（3）离子交换层析原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换反应，由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。（4）电泳通过氨基酸在电场中泳动而达到分离各种氨基酸的技术5、氨基酸的一般生产方法（1）水解法1）酸水解法：6~10mol/L的盐酸，110~120℃，12~24h2）碱水解法：4~6mol/L的氢氧化钠或2~4mol/L氢氧化钡，100~110℃，6~24h3）酶水解法：蛋白酶，适宜的温度、Ph值（2）微生物发酵法（3）化学合成法（4）酶合成法二、多肽1、多肽的结构肽是由一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基脱水缩合而形成的多聚化合物。其中的氨基酸单位称氨基酸残基。氨基酸间缩水形成的共价键称肽键。（1）肽键甘氨酰甘氨酸肽键的结构特点：C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转肽平面—由肽键周围的6个原子组成的刚性平面。两相邻的肽键平面可以作相对旋转。（2）肽链氨基酸的顺序是N端→C端的排列顺序2、多肽的性质（1）旋光性（2）两性解离及等电点（3）化学反应双缩脲反应：含有两个或两个以上肽键的化合物与碱性硫酸铜作用，生成蓝紫色的复合物，肽键越多颜色越深，受蛋白质特异性影响小，用于肽和蛋白质定量测定及测定蛋白质水解程度。3、生物体内的重要多肽有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在，这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。（1）谷胱甘肽GSH：在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还原酶的辅因子，作用是保护巯基酶，或防止过氧化物积累γ-COOH（2）激素类多肽：如促甲状腺素释放激素（TRH）（3）抗生素类多肽：如短杆菌肽S第二章蛋白质化学一、蛋白质概论1、定义：是一切生物体中普遍存在的，由天然氨基酸按照一定的顺序，通过肽键连接而成的一条或多条肽链构成的生物大分子；其种类繁多，各具有一定的相对分子质量、复杂的分子结构和特定的生物功能；是表达生物遗传性状的一类主要物质。2、生物学重要性（1）蛋白质是生物体的重要组成成分——分布广、含量高（2）具有重要的生物学功能1）催化生物化学反应（酶）2）结构成分(结缔组织的胶原蛋白、皮肤的弹性蛋白、膜蛋白)3）贮藏（卵清蛋白、种子蛋白）4）物质运输（血红蛋白、脂蛋白、电子传递体）5）细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白）6）激素功能（胰岛素）7）防御功能（抗体、血凝蛋白）8）接受传递信息（受体蛋白、味觉蛋白）9）调节细胞生长、分化和遗传信息的表达（组蛋白）（3）氧化供能3、蛋白质的元素组成主要有C、H、O、N和S各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％，这是凯氏定氮法测蛋白质含量的理论依据：蛋白质含量＝蛋白质含N量×6.254、蛋白质的分类（1）按组成分类1）单纯蛋白质：只含有氨基酸组成例如RNA酶、血清清蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白、角蛋白。2）结合蛋白：由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成，这些非蛋白成分包括糖、脂、核酸、色素等，又称为辅基或配体。（2）按外形分类1）球状：外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。但肌动蛋白属于球状蛋白却不溶于水。2）纤维状：分子类似纤维或细棒。①不溶性纤维状蛋白质：大多数纤维状蛋白质属此类如胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、丝蛋白。②可溶性纤维状蛋白质：肌球蛋白和血纤蛋白原可溶于水。（3）按多肽链条数1）单体蛋白质：仅含一条多肽链，如牛核糖核酸酶2）多聚蛋白质：含两条或多条多肽链，如胰岛素、血红蛋白二、蛋白质的分子结构层次1、一级结构：蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序，即氨基酸的线性序列。一级结构中包含的共价键主要指肽键和二硫键。包括组成蛋白质的多肽链数目、多肽链的氨基酸顺序、多肽链内或链间二硫键的数目位置。（1）一级结构测定的原则和基本流程原则：将大化小，逐段分析，制成两套肽片段，找出重叠位点，排出肽的前后位置，最后确定蛋白质的完整序列。基本流程：1）拆分蛋白质分子的多肽链——获得单条线形多肽链①拆分非共价键：可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理。②拆分二硫键：8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的β-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基。2）鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基——为氨基酸序列排列建立两个重要的参考点①N端分析法：A.二硝基氟苯法（DNFB法、Sanger降解法）B.丹磺酰氯法（DNS法）C.苯异硫氰酸(酯)法（PITC法、Edman降解法）D.氨肽酶法②C端分析法：A.肼解法：多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。3）用两种或几种不同的断裂方法将多肽链裂解成较小的片段——化大为小，获得短肽段①酶解法：胰蛋白酶（赖氨酸和精氨酸的侧链），胰凝乳蛋白酶（苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的侧链），胃蛋白酶（疏水性氨基酸处，pH2~3），嗜热菌蛋白酶等。②化学法：溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。4）测定各肽段的氨基酸序列;方法：蛋白质序列分析仪5）重建完整多肽链的一级结构——获得多肽链的完整序列利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。6）确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置对角线电泳步骤：①碘乙酰胺封闭-SH②胃蛋白酶酶切蛋白质（pH2）③第一向电泳（pH6.5）④过甲酸氧化处理-S-S-键生成-SO3H⑤第二向电泳（pH6.5）⑥分离出含二硫键的两条短肽⑦测序，与拼接出的多肽链比较，确定二硫键的位置。7）酰胺基位置的确定方法：酶解肽链，产生含有单个Asx或Glx的肽，用电泳法确定是Asp还是Asn。2、二级结构蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。主要化学键为氢键。（1）二级结构单元的种类1）α-螺旋主要特点：①绝大多数天然蛋白质都是右手螺旋；②每隔3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈；每圈间距0.54nm，即每个氨基酸残基沿螺旋中心轴上升0.15nm，旋转100°。③每个氨基酸残基的N-H都与前面第四个残基的C=O形成氢键④螺旋体中所有氨基酸残基侧链都伸向外侧；链中的全部C=O和N-H几乎都平行于螺旋轴,氢键几乎平行于中心轴;侧链在α-螺旋结构的影响：①α-螺旋遇到Pro就会被中断或拐弯，因为脯氨酸是亚氨基酸且有刚性的环状结构,且无H原子来形成氢键②R为Gly时，由于Cα上有2个氢，使Cα-C、Cα-N的转动的自由度很大，即刚性很小，所以使螺旋的稳定性大大降低。R基大(如Ile)也不易形成α-螺旋。③带相同电荷的氨基酸残基连续出现在肽链上时，螺旋的稳定性降低。④R基较小,且不带电荷的氨基酸利于α-螺旋的形成,如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自发卷曲成α-螺旋。2）β-折叠β-折叠是由两条或多条伸展的多肽链靠氢键联结而成的锯齿状片状结构①α-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸残基之间的轴心距为0.35nm。②β-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。③β-折叠有两种类型：平行式，即所有肽链的N-端都在同一边；反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。后者更为稳定。3）β-转角（β-回折）存在于球状蛋白中，其特点是肽链回折180°使得氨基酸残基的C=O与第四个残基的N-H形成氢键，第二个氨基酸通常是pro。β-转角都在蛋白质分子的表面，多数为亲水氨基酸组成。4）无规则卷曲（自由卷曲）指没有一定规律的松散肽链结构，但是其结构是明确而稳定的，常常构成酶的功能部位。无规卷曲常出现在α-螺旋与α-螺旋、α-螺旋与β-折叠、β-折叠与β-折叠之间。它是形成蛋白质三级结构所必需的。3、超二级结构（模块/模序）指蛋白质中相邻的二级结构单位(即单个α-螺旋或β-转角)组合在一起，形成有规则的在空间上能辩认的二级结构组合体。在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域。基本形式：αα、βββ、βαβ4、结构域指多肽链在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体，称为结构域5、三级结构多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上，主链构象和侧链构象相互作用，进一步盘曲折叠形成球状分子结构。（1）结构特征：①含有多种二级结构单元；②具有明显的折叠层次；③分子呈现球状或椭圆状；④大多数非极性侧链埋在分子内部，形成疏水核；而极性侧链在分子表面，形成亲水面。⑤分子表面往往有一个内陷的空隙，它常常是蛋白质的活性中心。（2）维持三级结构的作用力共价键——二硫键；非共价键——疏水作用、氢键、离子键、范德华力6、四级结构由两条或两条以上具有三级结构的多肽链聚合而成、有特定三维结构的蛋白质构象。每条多肽链又称为亚基。结构特征：①有多个亚基②稳定性主要靠亚基间的疏水作用维持③亚基单独存在时无生物活性或活性很小，只有通过亚基相互聚合成四级结构后，蛋白质才具有完整的生物