解淀粉芽孢杆菌的培养基优化和放大研究

AdvancesinMicrobiology微生物前沿,2018,7(3),107-114PublishedOnlineSeptember2018inHans.://doi.org/10.12677/amb.2018.73013文章引用:严国富,赵从波,杨攀科,汤洁.解淀粉芽孢杆菌的培养基优化和放大研究[J].微生物前沿,2018,7(3):107-114.DOI:10.12677/amb.2018.73013ResearchontheOptimizationofFermentationMediumandScale-UpTechnologyofBacillusamyloliquefaciensGuofuYan*,CongboZhao,PankeYang,JieTangLeiliMarineBioindustryInc.ofBeijing,BeijingReceived:Sep.3rd,2018;accepted:Sep.14th,2018;published:Sep.21st,2018AbstractTheoptimizedfermentationmediumwasobtainedbyPBdesignandorthogonalexperimentalde-sign.Basedonfermentationconditionin50Lbiologicalreactor,theexperimentwasscaledupinto400LfermentoronthebasisofsameKLa.TheresultsindicatedthatthelivingbacteriacountofBacillusamyloliquefacienswasmainlyinfluencedby(NH4)2SO4,cornmeal,cornsteepliquorandglucose.Theobtainedfermentationmediumwasasfollowscornmeal8g/L,glucose12g/L,(NH4)2SO40.8g/L,andcornsteepliquor7g/L.Thefermentationconditionof50Lbiologicalreac-torwasasfollowsthetemperature30˚C,theinoculationrate1%,thespeed200r/minin0-8hoursand250r/minafter8hours,theventilationquantity15-40L/minandthefermentationtimeabout30hours.Thefermentationconditionof400Lbiologicalreactorwasasfollowsthetemperature30˚C,thespeed130r/minin0-8hoursand160r/minafter8hours,theventilationquantity9-15m3/handthefermentationtimeabout30hours.Underthecondition,thelivingbacteriacountwas2.5×109/mL.KeywordsBacillusamyloliquefaciens,PBDesign,OrthogonalExperimentalDesign,Scale-UpTechnology解淀粉芽孢杆菌的培养基优化和放大研究严国富*，赵从波，杨攀科，汤洁北京雷力海洋生物新产业股份有限公司，北京收稿日期：2018年9月3日；录用日期：2018年9月14日；发布日期：2018年9月21日*通讯作者。严国富等DOI:10.12677/amb.2018.73013108微生物前沿摘要采用PB设计和正交试验设计优化解淀粉芽孢杆菌发酵培养基，在50L发酵罐发酵条件基础上采用以体积溶氧系数为基准的放大法进行了比拟放大。结果表明，(NH4)2SO4、玉米粉、玉米浆和葡萄糖的质量浓度是影响有效活菌数的主要因素，最优组合为玉米粉8g/L、葡萄糖12g/L、(NH4)2SO40.8g/L、玉米浆7g/L；50L发酵罐发酵条件：温度30℃，接种量1%，搅拌转速0~8小时200r/min，8小时后250r/min，通风量15~40L/min，发酵周期30小时，放大罐的发酵工艺：温度30℃，搅拌转速0~8小时130r/min，8小时后160r/min，通风量9~15m3/h，有效活菌数为2.5×109/mL。关键词解淀粉芽孢杆菌，PB设计，正交设计，比拟放大Copyright©2018byauthorsandHansPublishersInc.ThisworkislicensedundertheCreativeCommonsAttributionInternationalLicense(CCBY).引言解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，具有抑制植物病害的能力，能够产生多种代谢产物，主要包括：抑菌蛋白类，脂肽类蛋白质，伊枯草菌素A，表面活性物质，芬芥素，芽孢菌素D，大环内酯类，寡肽酶，肽类，聚酮化合物等[1]-[6]。解淀粉芽孢杆菌对多种作物的致病真菌有较好的抑制效果，可制成生物制剂应用于植物病害防治上，因此其发酵工艺和比拟放大的研究具有非常重要的意义。实验室分离的解淀粉芽孢杆菌(保藏号：CGMCC5043，专利号：ZL201210293465)能够降低灰霉病、立枯病、根腐病和炭疽病等多种农作物病害的发病指数。本实验能过PB设计和正交试验设计优化了菌株的培养基，同时在50L发酵罐中进行了扩大培养，并采用以体积溶氧系数为基准的放大法进行了比拟放大，为下一步工业化生产提供理论基础。2.材料与方法2.1.材料2.1.1.菌株解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens，由北京雷力集团技术研发中心保藏。2.1.2.培养基斜面培养基(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5，葡萄糖5，酵母粉5，琼脂20。液体种子培养基(g/L)：玉米淀粉10，蛋白胨10，NaCl10，酵母粉5。初始发酵培养基(g/L)：玉米粉12，豆饼粉18，CaCO35，葡萄糖8，(NH4)2SO41，玉米浆5，MgSO42，MnSO40.5。2.2.方法2.2.1.培养条件菌种活化：将保藏于斜面的菌株转接到斜面培养基上，30℃培养24小时，4℃保存备用。OpenAccess严国富等DOI:10.12677/amb.2018.73013109微生物前沿液体种子液制备：试管斜面中加10mL无菌水，刮下菌体，倒入90mL无菌水中，摇床振荡30分钟，制备成菌悬液。取30mL种子培养基于150mL三角瓶中，灭菌。接种菌悬液1mL，置于摇床中培养15~18小时，培养温度30℃，转速200r/min。摇瓶发酵培养：取30mL发酵培养基于150mL三角瓶中，灭菌，接种0.3mL种子液，置于摇床中培养28~32小时，培养温度30℃，转速220r/min。2.2.2.测定方法比浊法：发酵液1000r/min离心10分钟，上清液稀释至一定倍数，用721分光光度计(波长600nm)测定发酵液，以蒸馏水做对照。以光密度值OD600为标准判断菌数。菌落计数：执行国家标准GB20287-2006。2.2.3.PB(Plackett-Burman)设计PB设计法是一种两水平的试验设计方法，它可以用最少的试验次数使各因素的主效应得到尽可能精确的估计，从众多考察因素中快速筛选出最为重要的几个因素。选用实验次数N=12的设计，对初始培养基中的8种成分进行二水平设计，从中选出对解淀粉芽孢杆菌有效活菌数影响较大的因素[7][8]。实验选用次数N=12的设计，培养基中的8种成分：玉米粉，豆饼粉，CaCO3，葡萄糖，(NH4)2SO4，玉米浆，MgSO4，MnSO4，分别作为PB设计中的8个因素，每个因素取两个水平，低水平“−1”为原始培养条件，高水平“1”取低水平的1.25倍，PB设计实验水平及编码见表1。2.2.4.正交试验根据PB设计试验结果，选择对解淀粉芽孢杆菌有效活菌数影响较大的4个因素，并确定试验水平，采用L9(34)正交表进行四因素三水平正交试验优化培养基配方，每个处理设3次重复。2.2.5.发酵罐放大在摇瓶发酵的基础上，进行了50L发酵罐放大，发酵条件：装料系数0.6，温度30℃，接种量1%，压力0.05MPa，搅拌转速250r/min，pH值自然，通风量15~40L/min。在50L发酵罐基础上，根据Kla(体积溶氧系数)相同的原则进行发酵罐放大。根据公式计算KLa；()3530pPN60DN210ρ−××＝0.392330g0.08P2.2510pNDQ−×＝()()0.560.70.79dik2.263.3NPgVN10sυ−=+×P0——无通气时搅拌器输入液体的功率(千瓦)N——涡轮搅拌器转速(转/分)D——搅拌器直径(米)ρ——发酵液密度(公斤/米3)Np——功率准数，试验罐和放大罐均为2档圆盘六平直叶涡轮，取常数6Pg——通气时搅拌器输入液体的功率(瓦)Q——通气量(毫升/分)kd——溶氧系数(()p⋅⋅摩尔氧毫升分大气压)严国富等DOI:10.12677/amb.2018.73013110微生物前沿Ni——涡轮个数V——发酵液体积(米3)υs——发酵罐空截面空气线速度(厘米/分)3.结果分析3.1.PB设计筛选主要因素数据分析采用Mintab17软件进行，响应值(Y)为有效活菌数。实验设计及结果如表2所示，各因素效应及评价表如表3所示。由PB设计结果得出回归方程：Y17.6251.67510.44220.32530.67541.77551.44260.15870.3928=−×+×−×+×−×+×−×+×。(NH4)2SO4、玉米粉、玉米浆和葡萄糖对有效活菌数的影响较大，其中(NH4)2SO4和玉米粉为负效应，降低浓度可提高活菌数，玉米浆和葡萄糖为正效应，提高浓度可提高活菌数。Table1.PBdesignexperimentaldesignlevelandcoding表1.PB设计实验设计水平及编码因素编码水平(g/L)−11玉米粉x11215豆饼粉x21822.5CaCO3x356.25葡萄糖x4810(NH4)2SO4x511.25玉米浆x656.25MgSO4x722.5MnSO4x80.50.625Table2.PBdesignexperimentaldesignandresults表2.PB设计实验设计及结果序号x1x2x3x4x5x6x7x8Y/(亿∙mL−1)1−11−1−1−111122.321−111−11−1−118.33−111−11−1−1−114.341−11−1−1−11115.35111−111−1116.661−1−1−1111−113.6711−111−11−114.38−1−1111−11116.09−1111−111−123.31011−11−1−1−1117.611−1−1−1−1−1−1−1−119.612−1−1−1111−1120.3严国富等DOI:10.12677/amb.2018.73013111微生物前沿Table3.PBdesignexperimentfactorseffectandevaluationtable表3.PB设计实验各因素效应及评价表项效应F值显著性排序x5−3.55021.201x1−3.35018.882x62.88313.993x41.3503.074x20.8831.315x80.7831.036x3−0.6500.717x7−0.3170.1783.2.正交试验优化培养基根据PB试验的筛选结果，(NH4)2SO4、玉米粉、玉米