caspase信号通路教程

信号通路caspase信号通路Caspase与细胞凋亡前景与展望信号通路（signalpathway）：当细胞里要发生某种反应时，信号从细胞外到细胞内传递了一种信息，细胞要根据这种信息来做出反应的现象，叫做信号通路。分类：1.当信号分子是胆固醇等脂质时：可以轻易穿过细胞膜，在细胞质内与目的受体相结合；2.当信号分子是多肽时：只能与细胞膜上的蛋白质等受体结合，这些受体大都是跨膜蛋白，通过构象变化，将信号从膜外域传到膜内域，然后再与下一级别受体作用，通过磷酸化等修饰化激活下一级别通路。接收转导效应细胞外途径细胞内途径细胞内途径：由线粒体介导的内源性凋亡通路是哺乳动物细胞程序性死亡的主要途径。凋亡刺激-死亡促进因子（DPF），包括细胞色素C、凋亡诱导因子（AIF）、促死亡蛋白、caspase酶原的释放-dATP、ATP存在下活化caspase-细胞凋亡。细胞外途径：细胞死亡信号蛋白盘绕粘附到它的同源细胞表面接收器上，死亡配体与其受体结合，导致其死亡结构域相互积聚，并与转接器分子的死亡结构域相互结合，使死亡受体分子活化。导致细胞内pro-caspase局部聚集，FADD与募集的pro-caspase-8地DED（长原域中包含的死亡效应域结合形成信号复合物，使pro-caspase-8自我水解、活化，形成活性caspase-8。激活的caspase-8激活下游caspase，引起细胞凋亡。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinylaspartatespecificproteinase，Caspase)：是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白酶。它们的活性位点均包含半胱氨酸残基，能够特异性的切割靶蛋白天冬氨酸残基上的肽键，故名。生理作用：1.真核细胞凋亡，2.细胞生长、3.分化与凋亡作用机理：caspase负责选择性地切割某些蛋白质，从而造成细胞凋亡。在正常的细胞内，每一种caspase都是以非活性状态存在的，这种非活性的caspase称作酶原（zymogen），它是酶的非活性前体，其肽链比有活性时长一些，将多出的部分切除，就转变成有活性的caspase。Caspase家族蛋白酶的识别序列及作用底物Caspase家族蛋白酶的结构特征Caspase家族蛋白酶的同源性Caspase蛋白酶在细胞凋亡中的活化顺序Caspase蛋白酶在死亡受体介导的细胞凋亡中起着中心的作用Caspase蛋白酶家族Caspase家族蛋白酶的识别序列及作用底物蛋白酶别名序列底物caspase1ICEYVADpro-IL-1b,pro-caspase3,pro-caspase4caspase4TX,ICH-2,ICErel-IIpro-caspase1caspase5ICErel-III,TYmICH3mICH4caspase2ICH-1PARPcaspase9ICE-LAP6,Mch6PARPcaspase3CPP32,Yama,apopainDEVDPARP,DNA-PK,SRE/BP,rho-GDI,KCqcaspase6Mch2VEIDlaminAcaspase7Mch3,ICE-LAP3,CMH-1DEVDPARP,pro-caspase6caspase8MACH,FLICE,Mch5DEVDpro-caspase3,4,7,9,10caspase10Mch4YVADcaspase11ICH3,FLICE2CED-3Caspase家族蛋白酶的结构特征Caspase家族蛋白酶的同源性Caspase-1亚族：Caspase-1、4、5、11；Caspase-2亚族：Caspase-2、9；Caspase-3亚族：Caspase-3、6、7（细胞凋亡执行者）、8、10。Caspase蛋白酶在细胞凋亡中的活化顺序分类：1.起始者（initiators），起始Caspase在外来蛋白信号的作用下被切割激活，激活的起始Caspase对执行者Caspase进行切割并使之激活2.执行者（executioners）被激活的执行者Caspase通过对caspase靶蛋白的水解，导致程序性细胞死亡1.Fas与配体结合而活化后，2.引起YVAD和zVAD敏感的ICE家族蛋白酶活化，3.活化DEVD敏感的蛋白酶。其中caspase-8是这一凋亡过程中首先被活化的ICE家族蛋白酶。4.Caspase-8活化后，①剪切活化caspase-3、caspase-7、caspase-4、caspase-9和caspase-10，通过这些蛋白酶剪切底物使凋亡得以进行；②活性被CrmA所抑制，籍此可作为细胞凋亡负调控因素作用的环节。Caspase蛋白酶在死亡受体介导的细胞凋亡中起着中心的作用Caspase蛋白酶家族Caspase-1(ICE)，IL-1转化酶(IL-1convertingenzyme)：是单核细胞合成的一种蛋白酶，可以将34kD的IL-1前体剪切为17kD的成熟IL-1，这对于IL-1活性发挥是必须的。不表达ICE细胞系转化IL-1基因后可产生pro-IL-1，但不能分泌有活性的成熟IL-1；ICE特异性抑制剂可以阻断金黄色葡萄球菌刺激引起的IL-1的分泌。ICE属于半胱氨酸蛋白酶，活性中心有高活性的巯基，对氧化剂很敏感，但对丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶的抑制剂不敏感。Caspase-2：细胞发生凋亡时，48kDa的caspase-2先被一种caspase-3样蛋白酶在Asp316剪切成p33和p14，然后再缓慢地在Asp152和Asp330处剪切为p18和p12组成的活性蛋白酶，后一过程要在2~3h后才能完成。caspase-2可能参与CTL细胞的杀伤作用，但它并不能被颗粒酶B直接活化，必须被一种caspase-3样蛋白酶活化。Caspase-3：1994年Fernandez-Alnemri等在BenBank表达序列标记(expressionsequencetag,EST)数据库中找到一段ICE/CED-3活性中心同源的序列，用它合成探针后，筛选人JurkatT淋巴细胞cDNA文库，从中克隆到一种新基因，因其编码分子量为32kD的半胱氨酸蛋白酶而称之为CPP32(cysteineproteaseprotein,32kD)。随后，其它学者独立地将这一蛋白基因克隆出来，并分别命名为prICE、apopain(凋亡素)和Yama(印度传说中的死亡之神)。1996年这种蛋白酶被命名为caspase-3。现在一般认为caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是CTL细胞杀伤机制的重要组成部分。Caspase蛋白酶家族Caspase-4：caspase-4基因定位于人染色体11q22.2-22.3，所编码的蛋白包含377aa，分子量约43kD，一级结构与ICE有53%的同源性，在切除104aa的原结构域后同源性更高达60%，所有与酶活性中心(QACRG)和与结合底物有关的氨基酸残基都得到了保留。虽然caspase4与ICE高度同源，但它并不能催化pro-IL-1为成熟分子，但可以活化ICE前体及其自身的前体。caspase4不能剪切DNA-PK，ICE敏感的抑制剂YVAD-CHO可以阻断caspase4的活性，但其敏感性仅为ICE的1/20。caspase-4的活性形式也是由P20和P10两种亚基组成。Caspase-5：caspase-5包含418aa，分子量47.7kD，与ICE有51%的同源性，并具有保守的活性中心QACRG。但caspase-5不能剪切pro-IL-1，在过量表达时可以诱导凋亡的发生。Caspase-6：caspase6是通过搜索有保守的QACRG活性中心和GSWFI保守的抑制剂结合位点的方法用PCR的手段找到的，与caspase-3有38%同源性，可以在昆虫细胞中引起细胞凋亡。随后的研究证明，caspase6可以剪切层蛋白B，而且其活性对Zn2+敏感，这是唯一一个可以剪切层蛋白的caspasecaspase识别的序列也是VEID。它不能剪切U1-70K和DNA-PK，但可以部分剪切PARP，并可活化caspase3。Caspase蛋白酶家族Caspase-7（Mch3，ICE-LAP3，CMH1）：caspase-7包含304aa，分子量35kD，caspase-7是与caspase-3同源性最高的成员，有58%的同源性，与其它caspase有35%的同源性。caspase-7与caspase-3的同源区主要在具有酶活性的亚单位区，它也保留了QACRG(184~188)五肽活性中心，与底物结合的氨基酸残基也都存在。caspase-7可以分别在Asp23~Ala24、Asp198~Ser199和Asp206~Ala207之间被剪切，形成P20/P12形式的caspase-7。caspase-7分布很广泛，在脑中也有少量存在。用抗caspase-7的单抗发现caspase-7在Jurkat细胞中主要分布于胞浆和近膜结构中，细胞核中未见分布。用caspase-7基因转染乳腺癌细胞系发现全长蛋白不能引起细胞凋亡，但去除氨基端53aa(其中包括原结构域)的caspase-7则可以引起细胞凋亡。进一步研究证明去除原结构域的caspase-7具有自催化作用，可以自动催化成P10/P12形式。酶活性中心的半胱氨酸对caspase-7的这种作用十分重要，突变为Ala后就失去致凋亡作用。当Fas和TNF引起的细胞凋亡时细胞内caspase-7也被活化，CrmA可以阻断caspase-7引起的细胞凋亡。caspase7不能剪切pro-IL-1，但它可以剪切PARP和固醇调节元件，caspase-7对PARP的剪切可以被DEVD-CHO所阻断，但不能被ICE敏感的YVAD-CHO所阻断。caspase-7对DEVD-CHO抑制剂的敏感性只有caspase-3的1/3，对CrmA则很不敏感。Caspase蛋白酶家族Caspase-8：在caspase-8发现之前，人们虽然知道多种细胞膜外的因素可以引起细胞凋亡，而且知道caspase家族蛋白是这种细胞凋亡过程中的效应物质，但对凋亡信号如何由细胞膜外转递到细胞浆，并如何引起caspase蛋白酶活化的过程却知之甚少。含有死亡结构域的胞浆信号蛋白的发现，证明死亡信号是通过这些蛋白质向胞浆内部传递，并最终引起caspase蛋白酶的活化的。caspase-8的分布很广泛，在许多胚胎和成人组织中都有分布。颗粒酶B可以活化caspase-8，活化后可以剪切PARP。乳腺癌细胞系MCF7转染caspase-8基因后出现凋亡，这种作用可以被z-VADfmk所阻断。当活性中心的半胱氨酸被突变后，caspase-8失去促凋亡的作用。Caspase-9（ICE-LAP6）：编码414aa，分子量46kD。序列分析表明它也属于ICE/CED-3家族，在相当于ICE活性部分的序列中，caspase-9与其它成员有30%左右的同源性，它的原结构域很长，与caspase-3相似。在caspase-9中与结合底物有关的6个氨基酸残基都得到了保留，但它的酶活性中心的五肽序列与其它ICE/CED-3蛋白酶的QACRT不同，是QACGG，这是继caspase-8的QACQG之后出现的另一种活性中心变异，这种变异也不影响蛋白酶的酶切活性。Caspase蛋白酶家族Caspase-10:caspase-10含有497aa，分子量55kD，与其它成员有30~50%的同源性。caspase-10分子结构的显著特点是其N端也有两个FADD氨基端样结构域，所以它也可能与caspase-8一样是将细胞膜事件转化为细胞浆事件的一个环节。caspase-10的酶活性中心也与caspase-8一样，是QACQG，而不是一般的QACRG五肽序列。caspase-10分布广泛，基因定位于2p12，基因转染昆虫细胞系Sf9中可以引起细胞凋亡，其活性可以被DEVD-CHO所抑制。Caspase-11I（CH-3）:373aa，