孕妇外周血中胎儿游离DNA在产前诊断中的应用

书书书·４４２　　·第二军医大学学报　２００９年４月第３０卷第４期ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｊｓｍｍｕ．ｃｎＡｃａｄｅｍｉｃＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｅｃｏｎｄＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ａｐｒ．２００９，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．４ＤＯＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１００８．２００９．００４４２·综　述·孕妇外周血中胎儿游离ＤＮＡ在产前诊断中的应用王文博１，２，张　毅２，孙树汉２１．第二军医大学学员十队，上海２００４３３２．第二军医大学基础部医学遗传学教研室，上海２００４３３［摘要］　孕妇外周血中胎儿游离ＤＮＡ的发现，为无创性产前诊断开辟了一条新途径。检测孕妇血浆中特异的胎儿ＤＮＡ序列已被用于胎儿性连锁疾病鉴定、ＲｈＤ血型检查和多种单基因遗传病的产前诊断；游离ＤＮＡ水平的变化还可被用作某些妊娠相关疾病如先兆子、早产和胎儿染色体疾病的临床诊断新指标。本文对母体外周血中胎儿游离ＤＮＡ的生化特征及其临床应用研究，进行了总结和分析。［关键词］　胎儿游离ＤＮＡ；游离核酸；无创性产前诊断；基因诊断；孕妇血浆［中图分类号］　Ｒ７１４．５５　　　［文献标志码］　Ａ　　　［文章编号］　０２５８８７９Ｘ（２００９）０４０４４２０５ＰｒｅｎａｔａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓｖａｌｕｅｏｆｆｒｅｅｆｅｔａｌＤＮＡｉｎｍａｔｅｒｎａｌｂｌｏｏｄＷＡＮＧＷｅｎｂｏ１，２，ＺＨＡＮＧＹｉ２，ＳＵＮＳｈｕｈａｎ２１．Ｎｏ．１０ＳｔｕｄｅｎｔＴｅａｍ，ＳｅｃｏｎｄＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００４３３，Ｃｈｉｎａ２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＭｅｄｉｃａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＢａｓｉｃＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＳｅｃｏｎｄＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００４３３［ＡＢＳＴＲＡＣＴ］　ＴｈｅｄｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｆｅｔａｌＤＮＡｐａｖｅｓａｎｅｗｗａｙｆｏｒｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅｐｒｅｎａｔａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓ．ＥｘａｍｉｎｉｎｇｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｆｅｔａｌＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｆｅｔａｌＤＮＡｈａｓｂｅｅｎｕｓｅｄｆｏｒｐｒｅｎａｔａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｓｅｘｌｉｎｋｅｄｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，ｆｅｔａｌｒｈｅｓｕｓＤｂｌｏｏｄｔｙｐｉｎｇａｎｄｓｉｎｇｌｅｇｅｎｅｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅｄｉｓｅａｓｅ．ＴｈｅｖａｒｉａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＤＮＡｌｅｖｅｌｓｃａｎａｌｓｏｂｅｕｓｅｄｆｏｒｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ，ｐｒｅｍａｔｕｒｅｄｅｌｉｖｅｒｙ，ａｎｄｆｅｔａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．ＴｈｉｓｐａｐｅｒａｉｍｓｔｏｒｅｖｉｅｗｔｈｅｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｃｈａｒａｃｔｅｒｓａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｆｅｔａｌＤＮＡｉｎｍａｔｅｒｎａｌｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｐｌａｓｍａ．［ＫＥＹＷＯＲＤＳ］　ｃｅｌｌｆｒｅｅｆｅｔａｌＤＮＡ；ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ；ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅｐｒｅｎａｔａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓ；ｇｅｎｅｄｉａｇｎｏｓｉｓ；ｍａｔｅｒｎａｌｂｌｏｏｄ［ＡｃａｄＪＳｅｃＭｉｌＭｅｄＵｎｉｖ，２００９，３０（４）：４４２４４６］［收稿日期］　２００８０９２７　　　　［接受日期］　２００８１１１８［基金项目］　国家科技支撑计划（２００６ＢＡＩ０５Ａ０５）．ＳｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＫｅｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲ＆ＤＰｒｏｇｒａｍｏｆＣｈｉｎａ（２００６ＢＡＩ０５Ａ０５）．［作者简介］　王文博，第二军医大学生物技术专业２００５级学员．Ｅｍａｉｌ：[e-mail]通讯作者（Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒｓ）．Ｔｅｌ：０２１８１８７１０５４，Ｅｍａｉｌ：[e-mail]；Ｔｅｌ：０２１８１８７１０５３，Ｅｍａｉｌ：[e-mail]　　产前筛查与诊断是妇产科保健的重要部分，对正常怀孕的妇女，通过孕期检查时的病史询问、母血清生化指标的检测、超声影像学的检查筛选出一部分高风险人群，再针对此组人群选择适宜的方法进行相关的产前诊断。传统产前诊断方法一般采用羊膜腔穿刺、绒毛膜取样和脐静脉穿刺等，它们都具有创伤性，有发生感染、出血甚至流产、死胎的可能。长久以来人们致力于利用孕妇外周血中存在的胎儿有核细胞进行无创性产前诊断，但由于母体外周血中胎儿有核细胞极少，每毫升血中仅有１～２个［１］，其分离、富集方法繁琐复杂，且价格昂贵，其临床应用至今不能推广。孕妇外周血中胎儿游离ＤＮＡ的发现为无创性产前诊断带来了新的希望，胎儿游离ＤＮＡ含量相对高，提取及分析过程简单，易于发展为可应用于临床的大样本高通量的检测方法［１］。另外胎儿ＤＮＡ在孕早期就可检测到，且分娩后很快被清除，不会受前次妊娠的影响。因此，对孕妇外周血中胎儿游离ＤＮＡ的检测及其临床应用研究将对无创性产前诊断技术的发展产生重大影响。１　孕妇外周血中胎儿ＤＮＡ的生物学特点１．１　胎儿游离ＤＮＡ的发现　早在几十年前，研究者就发现人体外周血中存在微量的游离核酸。１９７７～１９９０年，多个课题组先后在肿瘤患者的外周血中发现了具有肿瘤特征的游离ＤＮＡ，并且证实这些游离ＤＮＡ大多来自患者自身的肿瘤细胞［２］。在妊娠过程中，胎盘滋养层侵入子宫壁的机制类似于肿瘤细胞的入侵，不同之处在于妊娠的侵润具有时间和空间性；而在免疫学上，胚胎之于母体类似于肿瘤之于机体，有学者将胚胎的部分行为称为“伪恶性”。受此启发，Ｌｏ等［３］认为孕妇外周血中应该也存在胎儿的游离ＤＮＡ，并利用实时定量ＰＣＲ的方法从孕妇血浆的总游离ＤＮＡ中成功扩增出男性胎儿的Ｙ染色体特异性序列（ＳＲＹ基因序列），首次证实胎儿ＤＮＡ可以进入母体外周血循环，并以游离ＤＮＡ的形式稳定存在。第４期．王文博，等．孕妇外周血中胎儿游离ＤＮＡ在产前诊断中的应用·４４３　　·１．２　胎儿ＤＮＡ的来源与释放机制　尽管胎儿游离ＤＮＡ的存在已被众多学者所证实，但它们的来源及释放机制尚未完全阐明。一般认为胎儿游离ＤＮＡ释放到母血中的机制可能有以下３种：　　（１）胎儿有核细胞进入母体外周血后发生凋亡释放出游离ＤＮＡ。妊娠期进入母体血循环的胎儿细胞包括淋巴细胞、粒细胞和有核红细胞等。胎儿细胞有穿越绒毛毛细血管内皮和滋养层基膜的现象，胎儿细胞在穿越胎盘时可能发生凋亡。因此孕妇血浆中的游离胎儿ＤＮＡ可来源于进入母体血的胎儿有核细胞。但无法解释母体外周血中胎儿细胞很少而血浆中游离胎儿ＤＮＡ含量丰富。Ｌｏ等［４］测定出孕妇血浆中胎儿游离ＤＮＡ在早期和晚期妊娠含量是胎儿细胞ＤＮＡ的９７０倍和７７５倍。并且发现胎儿有核细胞数量跟游离ＤＮＡ浓度没有相关性，尤其在早产孕妇中，血浆游离胎儿ＤＮＡ显著升高而胎儿有核细胞并没有增加［５６］。分娩后胎儿游离ＤＮＡ于２ｈ内完全消失［４］，而胎儿有核细胞可存在于母血中长达２７年之久。因此，即便游离胎儿ＤＮＡ来源于进入母体的胎儿有核细胞，也只可能是很少部分。　　（２）胎儿ＤＮＡ经母胎界面进入母血。游离胎儿ＤＮＡ在羊水中的浓度近乎于母体血浆中的２００倍，推测浓度梯度可能导致ＤＮＡ分子的直接传输。虽然在脐血浆中可测得母源性ＤＮＡ，但仅占胎儿血循环总游离ＤＮＡ的０．９％（０．２％～８．４％），而母血中胎儿游离ＤＮＡ占母体血循环总游离ＤＮＡ的１４．３％（２．３％～６４％），说明游离ＤＮＡ虽可直接穿越胎盘屏障，但此来源的可能也很少。　　（３）胎盘滋养层细胞凋亡后释放游离的胎儿ＤＮＡ。该说法获得了较多的实验支持。胎盘滋养层是母体与胎儿之间进行物质交换的胎源组织，早期胚胎的滋养层发育很快，孕４周时滋养层间隙即被母血所充盈，滋养层细胞可侵入到子宫基层甚至充当子宫螺旋小动脉的管壁，所以，合体滋养层细胞可直接深入母血中。许多研究表明整个正常妊娠期都存在着胎盘细胞的凋亡，晚期胎盘细胞的凋亡更加明显，而且滋养层细胞占凋亡细胞的大多数（＞５０％）。滋养层细胞的不断凋亡对胎盘的正常发育、维持胎盘的组织结构和功能完整性具有重要作用。妊娠最早期的胎盘形成处于相对缺氧的环境，最近的研究发现缺氧使滋养细胞凋亡增加，释放含有ＤＮＡ的膜包裹凋亡小体［７］。先兆子的患者由于胎盘浅着床而导致绒毛滋养细胞缺氧损伤，进而诱发大量绒毛滋养细胞凋亡，目前已发现患有先兆子的孕妇血浆中胎儿ＤＮＡ水平明显高于正常妊娠妇女（５～１０倍），而且这种增高与疾病的严重程度相关。在可疑为先兆子但无临床症状及体征的妇女体内监测到胎儿游离ＤＮＡ含量增高，且后期这些孕妇最终发展为先兆子。这些研究均支持胎盘滋养层细胞在正常生理和病理状况下的凋亡和损伤是母血中胎儿ＤＮＡ的重要来源。１．３　胎儿ＤＮＡ的存在形式与特点　由于血浆游离胎儿ＤＮＡ主要来源于凋亡的细胞，因此其特征可能具有细胞凋亡的生化特性即基因组ＤＮＡ的片段化。Ｃｈａｎ等［８］研究了孕妇血浆ＤＮＡ片段的大小分布，表明孕妇血浆ＤＮＡ片段比非孕妇血浆ＤＮＡ片段长，且母体来源的ＤＮＡ比胎儿ＤＮＡ长，在３１例孕妇中血浆ＤＮＡ＞２０１ｂｐ的占５７％，而３４例非孕妇只占１４％，胎儿来源的ＤＮＡ仅有２０％＞１９３ｂｐ，但不超过３１３ｂｐ。目前对此现象尚无确切解释。由于上述研究只适用于＜８００ｂｐ的ＤＮＡ片断，Ｌｉ等［９］采用琼脂糖凝胶电泳、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和定量ＰＣＲ，使片段大小在１０～２０ｋｂ的ＤＮＡ也能得到分析，发现胎儿ＤＮＡ绝大部分＜３００ｂｐ，而母体来源的ＤＮＡ平均＞１ｋｂ。１．４　动力学性质　很多实验室都证实了胎儿游离ＤＮＡ在孕早期就在母血中出现，但各实验室检测到的具体时间不一致，存在波动。Ｌｏ等［１０］证实在妊娠７周就可以检测到胎儿游离ＤＮＡ，其浓度随妊娠周次的增加而增加。Ｒｉｊｎｄｅｒｓ等［１１］在辅助生殖的孕妇妊娠３７ｄ就检测到了胎儿游离ＤＮＡ，９周时检出率就达到１００％。随后Ｃｈａｎ等［１２］发现在晚孕阶段，胎儿游离ＤＮＡ平均每周增加２９．３％。尽管胎儿游离ＤＮＡ在母血循环中出现的时间和量有波动，但总的趋势还是随着孕周的增加而增加［１３１４］，且在晚孕阶段还会有一个急剧增加的时期。１．５　清除机制　孕妇血浆及血清中胎儿游离ＤＮＡ的清除是学者们关注的另一热点，因为它关系到本次妊娠所进行的各项产前诊断是否受到上次妊娠的影响，即假阳性率问题。虽然胎儿游离ＤＮＡ量在晚孕阶段急剧增加，但分娩后母血中胎儿游离ＤＮＡ很快就被清除。Ｌｏ等［４］对８名孕有男性胎儿的孕妇连续检测，发现大部分孕妇在产后２ｈ检测不到胎儿游离ＤＮＡ，当时估计胎儿游离ＤＮＡ平均半衰期是１６．３ｍｉｎ。说明分娩后胎儿游离ＤＮＡ在产妇体内被快速清除，研究中还表明血浆中的核酸酶仅对胎儿游离ＤＮＡ的清除起部分作用，肝、肾和脾脏可能对清除起主要作用。２　胎儿ＤＮＡ的制备及其检测技术２．１　胎儿ＤＮＡ的制备　在胎儿游离ＤＮＡ提取过程中，血样的放置时间、抗凝剂的使用、离心速度等都会影响提取ＤＮＡ的量和实验结果的准确性、可靠性。　　Ａｎｇｅｒｔ等［１５］考察了抽血后在ＥＤＴＡ抗凝管中放置时间对胎儿游离ＤＮＡ的影响，发现放置时间对ＤＮＡ总量有影响，而对胎儿游离ＤＮＡ无影响，胎儿游离ＤＮＡ在抽血后２４ｈ内都是稳定的，总ＤＮＡ的增加可能是由于细胞凋亡、细胞死亡和溶解引起的母源ＤＮＡ的增加。ＤＮＡ总量与胎儿游离ＤＮＡ检出的敏感性有关，母亲ＤＮＡ量的增加会降低低拷贝数目胎儿游离ＤＮＡ的检出。　　在血液样本抗凝剂的选择方面，大多数学者选用ＥＤＴＡ来抗凝，Ｌａｍ等［１６］证实，６ｈ内ＥＤＴＡ和肝素、柠檬酸钠效果无明显差别；而血样放置超过６ｈ，ＥＤＴＡ的效果优于肝素和柠檬酸钠等抗凝剂。目前胎儿游离ＤＮＡ一般采用２次离心之后取上层血浆用试剂盒来提取，然后应用实时定量ＰＣＲ对胎儿游离ＤＮＡ进行定量分析。第一次离心速度一般为１６００×ｇ左右，主要目的是