Folin-Ciocalteus法测定马铃薯中的总多酚

··DeterminationofTotalPolyphenolsinPotatoUsingFolin-CiocalteusMethodLIJing,NIEJiyun*,WUYonglong(InstituteofPomology,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Xingcheng,Liaoning125199,China)Abstract:Abstract:AnimprovedUVspectrophotometrymethodwasdevelopedforanalysisoftotalpolyphenolsinpotato.Folin-Ciocalteusmethodfortotalpolyphenolsdeterminationinpotatowasstudied.Afteraseriesofoptimizationexperiments,thebestdeterminationprocedureofFolin-Ciocalteusmethodwasputforward,thatis,5.0mLwater,1.0mLcolorationreagent,and3.0mL7.5%sodiumcarbonatesolutionwereaddedorderlyinto1.0mLextractionofsampleorstandardgallicacid,thenblended,andmeasuredat765nmaftercolorationfor2h.Underthisprocedure,relativestandarddeviationofthemethodwas7.7%,andaveragerecoveryratewas100%-108%.Thismethodisapplicabletoconventionallaboratorydeterminationoftotalpolyphenolsinpotato.KeyWords:KeyWords:potato;totalpolyphenols;Folin-CiocalteusFolin-Ciocalteus法测定马铃薯中的总多酚李静，聂继云*，毋永龙（中国农业科学院果树研究所，辽宁兴城125199）收稿日期：2013-07-10基金项目：农业行业标准研究项目(2013300）。作者简介：李静（1972-），女，副研究员，从事食品品质与营养检测及标准研究。*通信作者（Correspondingauthor）：聂继云，研究员，博士，主要从事果品品质和风险评估研究，E-mail:[e-mail]。中图分类号：S532文献标识码：B文章编号：1672－3635（2014）01-0027-03摘要：本文建立了紫外分光光度计法准确测定马铃薯中的总多酚。对影响Folin-Ciocalteus法测定马铃薯中总多酚含量的主要因素进行了研究，确定了在1.0mL样品提取液或标液中依次加入5.0mL水、1.0mL显色剂和3.0mL7.5％碳酸钠溶液，摇匀，显色2h后在765nm测定吸光度的最佳检测条件，并对马铃薯样品进行了测定，精密度为7.7％，回收率为100%~108%。本方法适用于常规实验室马铃薯总多酚的测定。关键词：马铃薯；总多酚；Folin-Ciocalteus法Folin-Ciocalteus法测定马铃薯中的总多酚——李静，聂继云，毋永龙马铃薯的多酚含量较高，在加工过程中，马铃薯中含有的多酚类物质与多酚氧化酶（PPO）作用氧化成醌，在进一步缩合成黑色素，引起褐变，影响制品的风味和营养[1,2]，因此在加工和育种中需要对多酚含量进行测定和监控。常用的植物中多酚测定方法有皮粉法、高锰酸钾滴定法、酒石酸亚铁螯合法、香草醛法、正丁醇-盐酸法、Folin-酚法、铁氰化钾分光光度法（PB法）和液相色谱法等[3-10]。测定蔬菜中总多酚常采用Folin－酚法，包括Folin-Denis法（即FD法）和Folin-Ciocalteus法（即FC法），FC法是FD法的改进方法，它是在FD试剂中加入锂盐，克服了FD试剂的不稳定性，较之更为灵敏[7,8]。虽已用于马铃薯中总多酚的测定[9,10]，但未见对其最佳测定的条件筛选，不利于马铃薯中总多酚的准确测定。本试验对用Folin-Ciocalteus法测定马铃薯中总多酚含量的测定条件进行了研究，筛选了最佳测定条件，获得了很好的精密度和准确度，为马铃薯中总多酚的准确测定提供了一定的参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1马铃薯样品市售马铃薯，洗净晾干，取可食部分切碎，液氮冷冻研磨，-80℃冷冻备用。1.1.2试剂钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂、磷酸、盐酸、溴水27··中国马铃薯，第28卷，第1期，2014和乙醇为分析纯。一水合没食子酸标样，Sigma－Aldrich公司。水为蒸馏水。1.1.3试剂的配制FC显色剂：称取50g±0.01g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)，12.5g±0.01g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)，用350mL蒸馏水溶于1000mL回流瓶中，加入25mL磷酸(H3PO4≥85%)及50mL浓盐酸，充分混匀，小火加热回流2h，再加入75g硫酸锂，25mL蒸馏水，0.5mL溴水，然后开口继续沸腾15min，冷却后定容500mL，过滤，置于棕色瓶中，用时加入1倍蒸馏水。7.5％碳酸钠溶液：称取37.5g±0.01g无水碳酸钠（Na2CO3）溶于250mL温水中，混匀，冷却，稀释至500mL。室温下至多保持1个月。一水合没食子酸标准溶液：准确称取0.110g±0.001g一水合没食子酸，用70%乙醇溶液溶解并定容到100mL容量瓶中，此溶液一水合没食子酸浓度为1000mg/L；用5mL分度吸管从此标准溶液吸取0.0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mL到100mL容量瓶中，用70%乙醇定稀释到刻度线，即相当于0.0,10,20,30,40,50μg/mL的一水合没食子酸标准溶液。1.1.4主要仪器紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、天平（日本岛津）、冷冻研磨机（美国SPEX）、恒温水浴锅。1.2试验方法1.2.1马铃薯中总多酚的提取取马铃薯可食部分，液氮冷冻后，用冷冻研磨机研磨成粉末状，称取样品粉末5g，精确到0.01g，用40mL70%乙醇溶液洗入50mL棕色离心管中，30℃超声30min，9000r/min离心5min，上清液倒入100mL容量瓶中，残渣再用70%乙醇溶液35mL重复提取1次，合并2次上清液，用70%乙醇溶液定容，备用。1.2.2标准曲线的制作用分度吸管从0.0，10，20，30，40，50μg/mL的一水合没食子酸标准溶液系列中吸取1.0mL，分别加5mL水，1mLFC显色剂，3mL7.5％碳酸钠溶液，显色，此时相当于0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0μg/mL的一水合没食子酸。放置2h后，在765nm波长下测定标准系列溶液的吸光度，绘制标准曲线（图1）。1.2.3样品的测定吸取1.0mL样品溶液，分别加入5.0mL水，1mLFC显色剂，3mL7.5％碳酸钠溶液，显色，放置2h后，在765nm波长下测定样品的吸光度，根据标准曲线分别求出样品中总多酚的浓度。2结果与分析2.1显色波长的选择对5.0mg/L没食子酸和马铃薯样品提取液在相同条件下显色，显色后分别进行光谱扫描（图2），从图2可见，样品提取物和没食子酸标准品具有相同的光谱图，说明，样品提取液同标准品是一类物质。样品提取物和没食子酸标准品显色后的在765nm处有最大吸收峰，因此选择测定波长为765nm。1.00.80.60.40.2002468y=0.1167x+0.0129R2=0.9993○○○○○○○○吸光度（765nm）Absorbance没食子酸浓度(mg/L)Concentrationofgallicacid图1没食子酸标准曲线Figure1Standardcurveofgallicacid3504505506507508509500.70.60.50.40.30.20.10××××××××××××××××××××××××××××××××××××××××××××××××××××波长(nm)Wavelength吸光度Absorbance图2没食子酸和马铃薯样品光谱扫描图Figure2Scanofgallicacidsolutionandextractionofpotato“×”表示没食子酸，“-”表示马铃薯，下同。×meangallicacid;-meanpotato.Thesamebelow.28··图3没食子酸和马铃薯显色稳定性Figure3StandingtimeofcoloringbyFCmethodingallicacidsolutionandpotato表1马铃薯的添加回收率Table1Resultofrecoveryexperimentationinpotatoes样品Sample马铃薯Potato样品多酚含量(mg/g)Polyphenocontent0.32添加没食子酸量(mg/g)Gallicacidadded0.20.4加入没食子酸后的测定值(mg/g)Valueaftergallicacidadded0.520.75回收率(％)Recovery100.0108.0表2马铃薯的测定结果及精密度Table2Resultofprecisionexperimentationinpotato样品Sample马铃薯Potato平行测定Measurement测定结果(mg/g)Determination0.370.320.320.350.300.320.310.290.31平均值(mg/g)Average0.32变异系数(％)Relativestandarddeviation7.70果的相对标准偏差为7.7％（表2），说明该方法测定结果具有较好的精密度。3讨论利用紫外可见分光光度计Folin－酚显色法测定马铃薯中总多酚时，测定的最佳波长和显色时间往往影响检测的灵敏度和测定的稳定性。本文通过对马铃薯提取液和标准品提取液的波长扫描筛选出马铃薯的最佳检测波长为765nm与周胜男和陆宁[9]测定马铃薯中总多酚时选择的测定波长相同，而同曹艳萍等[10]检测波长779nm有所不同。本试验通过马铃薯样品提取液和标准品显色后的稳定性监测，显色稳定时间为2h以上，这与周胜男和陆宁[9]以及曹艳萍等[10]选择的显色1h后测定均有所不同。通过对Folin－Ciocalteus显色法测定马铃薯中总多酚测定条件的摸索，确定马铃薯中总多酚的测定最佳测定条件为使用70%乙醇提取马铃薯中的总多酚，吸取1.0mL样品提取溶液，分别加入5.0mL水，1mLFC显色剂，3mL7.5％碳酸钠溶液，显色，放置2h后，在765nm波长下测定，此方法准确，回收率为100%~108%；精密度高，变异系数仅为7.7%，完全适用于马铃薯中总多酚的测定。[参考文献][1]吴文标,盛德贤,吕世安,等.马铃薯酚类化合物的研究[J].中国马铃薯,2001,15(3):158-162.[2]李敏,刘磊,郭玉荣,等.马铃薯多酚氧化酶的特性研究[J].甘肃农业大学学报,2005,40(2):189-192.[3]周卫龙,孙安华,钟萝.GB/T8313-2002,茶茶多酚测定[S].北2.2显色时间的选择对5.0mg/L没食子酸标样和马铃薯样品提取液显色后进行时间扫描（图3），从图3可见，标样及样品提取液在显色初期吸光度变化较大，而在2h（120min）后显色较稳定，因此选择2h后比色，测定，减小误差。2.3方法回收率试验对马铃薯进行2个不同梯度的添加，每个梯度平行测定5次，回收率在100％～108％范围内（表1），说明此方法具有较好的准确性。2.4马铃薯中总多酚含量的测定对马铃薯进行平行测定，各9次，平行测定结Folin-Ciocalteus法测定马铃薯中的总多酚——李静，聂继云，毋永龙0.80.60.40.200