抗氧化酶测定实验方法

1植物组织中丙二醛（MDA）含量的测定一、原理植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。MDA从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。因此，MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5—三甲基恶唑-2，4。二酮)，其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，但532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为每克千重100—300ug·g-1，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3+的终浓度为0．5umol·L-1。二、方法直线回归法MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下的吸光度值为零。不同浓度的蔗糖(0—25mmol·L-1)与TBA显色反应产物在450nm的吸光度值与532nm和600nm处的吸光度值之差成正相关，配制一系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后，测定上述三个波长的吸光度值，求其直线方程，可求算糖分在532nm处的吸光度值。UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为：Y532＝-0．00198十0．088D450(44—1)D450、D532、D600分别代表450、532和600nm波长下的吸光度值。三、材料、仪器设备及试剂1、[仪器设备]紫外可见分光光度计1台；离心机1台；电子天平1台；10ml离心管4支；研钵2套；试管4支；刻度吸管：10ml1支，2ml1支；剪刀1把。22、[试剂](1)10％三氯乙酸(TCA)；(2)0．6％硫代巴比妥酸：先加少量的氢氧化钠(1mol·L-1)溶解，再用10％的三氯乙酸定容；石英砂。四、步骤1．实验材料受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片或衰老的植物器官。2．MDA的提取称取剪碎的试材1g，加入2mll0％TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8mlTCA研磨，匀浆在4000r·min-1离心10min，上清液为样品提取液。3．显色反应和测定吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸馏水)，加入2ml0．6％TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532、600和450nm波长下的吸光度。4．计算含量(1)直线方程法按公式Y532=-0.00198十0.088D450(44—1)求出样品中糖分在532nm处的吸光度值Y532，用实测532nm的吸光度值减去600nm非特异吸收的吸光度值再减去Y532，其差值为测定样品中MDA—TBA反应产物在532nm的吸光度值。按MDA在532nm处的毫摩尔吸光系数为155换算求出提取液中MDA浓度。MDA(mmol﹒g-1Fw)=[6.452×(D532-D600)-0.559×D450]×vt/(vs×w)式中，Vt：提取液总体积（mL）；Vs：测定用提取液体积（ml）；FW：样品鲜重（g）。氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性3一、目的学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。二、原理SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：Mn－SOD和Cu.Zn－SOD，它们都催化下列反应：由于超氧自由基（O2.－）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.－，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），继而还原生成二甲月替，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比，以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线，根据SOD抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性。找出SOD抑制NBT光还原相对百分率为50％时的酶量作为一个酶活力单位（U）。三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料小麦、玉米、水稻、棉花等新鲜叶片2．主要仪器（1）722型或其他型号的可见分光光度计（2）万分之一分析天平（3）高速冷冻离心机（4）冰箱（5）光照箱：4500Lux（6）带盖瓷盘1个/处理（7）移液管架（8）研钵（9）离心管5mL数个（10）微烧杯10～15mL8个/处理（11）移液管或加样器0.5mL×4；1mL×2；2mL×2；5mL×1（12）微量进样器50μL×2；100μL×2（13）烧杯50mL×3；100mL×5；500mL×1；1000mL×2（14）量筒50mL×1；100mL×2（15）容量瓶50mL×1；100mL×5；250mL×1；1000mL×2（16）细口瓶125mL×543．试剂（1）0.1mol/LpH7.8磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液A液（0.1mol/LNa2HPO4溶液）：准确称取Na2HPO4·12H2O（MW=358.14）3.5814g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。B液（0.1mol/LNaH2PO4溶液）：准确称取NaH2PO4·2H2O（MW=156.01）0.780g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入50mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。取上述A液183mL与B液17mL充分混匀后即为0.1mol/LpH7.8的磷酸钠缓冲液。4℃冰箱中保存备用。（2）0.026mol/L蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液准确称取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.3879g于100mL小烧杯中，用少量0.1mol/LpH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1mol/LpH7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀（现用现配）。4℃冰箱中保存可用1～2d。（3）7.5×10－4mol/LNBT溶液准确称取NBT（C4OH3OCl2N10O6，MW=817.7）0.1533g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀（现配现用）。4℃冰箱中保存可用2～3d。（4）含1.0μmol/LEDTA的2×10－5mol/L核黄素溶液A液：准确称取EDTA（MW=292）0.00292g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。B液：准确称取核黄素（MW=376.36）0.0753g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。C液：合并A液和B液，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，此溶液为含0.1mmol/LEDTA的2mmol/L核黄素溶液。4℃冰箱中保存可用8～10d。该溶液应避光保存，即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好，置于4℃冰箱中保存。5当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1.0μmol/LEDTA的2×10－5mol/L核黄素溶液。（5）0.05mol/LpH7.8磷酸钠缓冲液取0.1mol/LpH7.8的磷酸钠缓冲液50mL，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。（6）石英砂。四、操作方法和步骤1．酶液的制备按每克鲜叶加入3mL0.05mol/LpH7.8磷酸钠缓冲液，加入少量石英砂，于冰浴中的研钵内研磨成匀浆，定容到5mL刻度离心管中，于8500r/min（10000g）冷冻离心30min，上清液即为SOD酶粗提液。2．酶活力的测定每个处理取8个洗净干燥好的微烧杯编号，按表1加入各试剂及酶液，反应系统总体积为3mL。其中4～8号杯中磷酸钠缓冲液量和酶液量可根据试验材料中酶液浓度及酶活力进行调整（如酶液浓度大、活性强时，酶用量适当减少）。各试剂全部加入后，充分混匀，取1号微烧杯置于暗处，作为空白对照，比色时调零用。其余7个微烧杯均放在温度为25℃，光强为4500Lux的光照箱内（安装有3根20W的日光灯管）照光15min，然后立即遮光终止反应。在560nm波长下以1号杯液调零，测定各杯液光密度并记录结果。以2、3号杯液光密度的平均值作为抑制NBT光还原率100％，根据其他各杯液的光密度分别计算出不同酶液量的各反应系统中抑制NBT光还原的相对百分率。以酶液用量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，作出二者相关曲线。找出50％抑制率的酶液量（μL）作为一个酶活力单位（U）。6表1反应系统中各试剂及酶液的加入量（mL）试剂杯号试剂（5）0.05mol/LpH7.8磷酸钠缓冲液试剂（2）0.026mol/L蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液试剂（3）7.5×10－4mol/LNBT溶液酶液试剂（4）1.0μmol/LEDTA的2×10－5mol/L核黄素溶液10.91.50.300.320.91.50.300.330.91.50.300.340.851.50.30.050.350.801.50.30.100.360.751.50.30.150.370.701.50.30.200.380.651.50.30.250.3五、结果计算1．560nm波长下各杯液的光密度（表2）表2测定数据列表杯号123456782、3号平均值酶液量（mL）0000.050.100.150.200.25—光密度（OD560nm）0抑制率（％）—100100100以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线。找出50％抑制率的酶液量（μL）作为一个酶活力单位（U）。2．SOD酶活力按下式计算A＝V×1000×60B×W×T式中各因子代表内容如下：7A：为酶活力（酶活力单位：U/g（FW）·h）；V：为酶提取液总体积（mL）；B：为一个酶活力单位的酶液量（μL）；W：为样品鲜重（g）；T：为反应时间（min）；1000：为1mL=1000μL；60：为1h=60min。3．抑制率按下式计算抑制率=D1—D2×100％D1D1：为2、3号杯液的光密度平均值；D2：为加入不同酶液量的各杯液的光密度值。注：有时因测定样品的数量多，每个样品均按此法测定酶活力工作量将会很大，也可每个样品只测定1个或2个酶液用量的光密度值，按下式计算酶活力。A＝(D1－D2)×V×1000×60D1×B×W×T×50％D1：为2、3号杯液的光密度平均值；D2：为测定样品酶液的光密度；50％：为抑制率50％；其它各因子代表的内容与上述SOD酶活力计算公式的各因子代表的内容相同。六、注意事项1．富含酚类物质的植物（如茶叶）在匀浆时产生大量的多酚类物质，会引起酶蛋白不可逆沉淀，使酶失去活性，因此在提取此类植物SOD酶时，必须添加多酚类物质的吸附剂，将多酚类物质除去，避免酶蛋白变性失活，一般在提取液中加1～4％的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。2．测定时的温度和光化反应时间必须严格控制一致。为保证各微烧杯所受光强一致，所有微烧杯应排列在与日光灯管平行的直线上。8过氧化氢酶(CAT)活性过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。紫外吸收法一、原理】H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时