抗氧化活性测定方法

抗氧化活性测定方法1.水解度（DH）的测定采用OPA（邻苯二甲醛）法，取3.00mLOPA溶液于试管中加入400μL稀释至一定倍数的水解上清液，精确反应2min后在340nm处测定吸光值。同时以丝氨酸标准溶液（0.9516mmol/L）作参考和空白试验。mmol/g7.72toth）,摩尔数（mmol/g每克原料蛋白的肽键毫tot数0.4和1表示；h式中：β、α分别以常(2)100％toth/αβ-2SerineNHDH清液体积N：稀释倍数；V：上含量；量；P：样品中的蛋白/g蛋白；X：样品重2serineNH：mmol2H式中：SerineN(1)proteinL/gPXVNmmol/L0.9516空白式样－OD标准样品OD空白式样OD待测样品OD2SerineNH2.酶解产物的相对分子质量的分布采用高效液相色谱法测定。取酶解液上清液稀释至一定浓度，微孔过滤膜过滤后上色谱柱。色谱条件：实验色谱柱：TSKgel2000SWXL（300mmx7.8mm），流动相：乙腈：水：三氟乙酸=45:55:0.1（V/V/V），检测波长220nm，流速0.5mL/min，柱温30℃，进样量10μL。3.DPPH清除能力测定取一定浓度的样品溶液4ml，加入1ml用甲醇配制的DPPH溶液，并使DPPH终浓度为0.2mmol/L。用力振摇混匀后置暗室中静置30min，于517nm处测定吸光度。按照下式计算DPPH清除率。DPPH清除率（％）=100*（1-（A2-A1）/A0），式中：A2是加入样品溶液后的吸光度；A1是样品溶液本底的吸光度；A0是空白对照液的吸光度。4.总还原能力测定称取一定浓度的样品溶液2.5mL，加入0.2mol/L磷酸缓冲液（pH6.6）和1％铁氰化钾溶液各2.5mL，混合均匀。混合液于50℃保温20min后。加入2.5mL10％三氯乙酸，混匀，3000r/min离心10min。取上清液5mL，加5mL蒸馏水和1mL0.1％FeCl3，混合均匀，10min后于700nm处测定吸光度，以此作为总还原能力指标。5.羟基自由基（•OH）清除能力的测定采用水杨酸法测定，利用H2O2和Fe2﹢混合产生•OH，在体系中加入水杨酸捕捉•OH显色。0.5mL的9.1mmol水杨酸乙醇溶液，0.5mL样品，0.5mL的9.1mmolFeSO4,3.5mL蒸馏水，最后加入5mL8.8mmolH2O2启动反应。涡旋震荡，反应0.5h后在510nm处测定吸光值。•OH自由基清除能力（%）=[（A0-A1）/A0]×100%，式中A0为空白对照组，A1为样品反应后的吸光值。6.O2-·清除能力测定采用邻苯三酚自氧化法测定。取50mmol/LTris—HCl缓冲液(pH8.2)4.5mL，置于25℃水浴中保温20min，分别加入lmL样品溶液和0．4mL,25mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5min，加入lmL8mmoFLHCI终止反应。于299nm处测定吸光度似As。空白对照组以相同体积蒸馏水代替样品。每个试样做3个平行样，取平均值，按下式计算O2-·清除率。O2-·清除率(％)=100x(Ao-As)/Ao，式中：Ao一空白对照液吸光度；As—样品溶液吸光度。